陳舒華 谷婷婷 劉湘 胡學(xué)鋒 肖紅云 周志明 吳彥嫻 張晴 何坤武

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma NPC）為鼻咽部上皮細(xì)胞來源惡性腫瘤細(xì)胞，以鱗狀細(xì)胞低分化癌多見，占90%[1]。中國及東南亞地區(qū)為鼻咽癌高發(fā)地區(qū)，我國以廣西、廣東、湖南、江西、福建等地區(qū)鼻咽癌高發(fā)[2]。研究發(fā)現(xiàn)我國鼻咽癌發(fā)病率及死亡率占全球鼻咽癌發(fā)病和死亡的38.29%和40.14%，發(fā)病率和死亡率高于世界平均水平（1.2/10 萬，0.7/10萬）[3]。鼻咽癌因其位置隱匿，當(dāng)出現(xiàn)鼻腔癥狀及體征時(shí)，多為臨床晚期，較多患者以頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來院就診。我國鼻咽癌患者發(fā)病率以青壯年多見，鼻咽癌死亡率以老年患者多[3]。鼻咽癌具有明顯遺傳傾向，且具有家族聚集傾向，對于鼻咽癌患者一級親屬進(jìn)行鼻咽癌篩查及監(jiān)測具有必要性[4，5]。S100A9分子蛋白為鈣離子結(jié)合蛋白，為S100 蛋白家族重要一員。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)普遍存在的第二信使，引發(fā)包括自分泌在內(nèi)的多種細(xì)胞過程代謝、細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長。鈣結(jié)合蛋白作為細(xì)胞內(nèi)鈣受體分子,細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化影響細(xì)胞功能上的變化。S100A9 分子蛋白為鈣離子結(jié)合蛋白，其參與細(xì)胞及組織的生長分化、生長抑制、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞信息通路傳導(dǎo)。本研究小組曾對鼻咽癌高癌家系進(jìn)行相關(guān)蛋白組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌高癌家系及散發(fā)鼻咽癌患者癌組織中S100A9 存在差異性表達(dá)，但其外周血淋巴細(xì)胞中S100A9 是否存在差異，尚不清楚。本研究探討鼻咽癌高癌家系氣虛型癌患者外周血淋巴細(xì)胞S100A9 的表達(dá)，報(bào)道如下。

資料與方法

1 臨床標(biāo)本

入組標(biāo)準(zhǔn)：高癌家系是指直系親屬中有3 個(gè)以上成員確診患癌癥，其中二個(gè)以上為鼻咽癌，鼻咽癌患者在取標(biāo)本前均未接受過放化療，且均為未分化非角化性鱗狀細(xì)胞癌；分期采用鼻咽癌2008 分期標(biāo)準(zhǔn)[6]。樣本均選自佛山市第一人民醫(yī)院頭頸放療科和佛山市第二人民醫(yī)院就診的患者，臨床及病理資料完備。收集高癌家系鼻咽癌患者外周血標(biāo)本、散發(fā)鼻咽癌患者外周血標(biāo)本各22 例，同時(shí)收集體檢中心正常人外周血標(biāo)本22 例，分別提取外周血單個(gè)核細(xì)胞備用。

2 主要試劑

BCA 定量試劑盒為Solarbio。兔抗人Hsp27 與兔抗人β-actin 均為Abcam 公司抗體。Thermo 公司辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG 二抗。RNA 提取試劑盒為QIAGEN 公司RNeasy mini kit74104 試劑盒。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Thermo 公司RevertA 外資id First strand CDNA synthesis kit#1622。real-time PCR 試劑盒為生物工程（大連）有限公司DRR420A SYBR Premix Ex Taq。PCR 引物為奧科鼎盛生物科技有限公司提供。

3 外周血淋巴細(xì)胞的制備

用EDTA 抗凝管抽取外周血10ml,迅速顛倒混止血液凝固。4h 內(nèi)用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，-80°冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4 Western blot 檢測

S100A9 蛋白表達(dá)的情況用RIPA 裂解液冰上裂解外周血淋巴細(xì)胞30min 后，BCA 法檢測并計(jì)算總蛋白濃度，每孔上樣40μg 蛋白后用BIO-RAD 垂直電泳系統(tǒng)分離目的蛋白，BIO-RAD 半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀電轉(zhuǎn) 30min。以 1∶3000 稀釋的 S100A9 及 1∶5000 稀釋的β-actin 抗體4℃孵育過夜，以1∶5000 稀釋的HRP 標(biāo)記羊抗兔 lgG（H+L）二抗結(jié)合一抗，ECL 發(fā)光液檢測蛋白相對表達(dá)量。

5 RT-PCR 檢測 S100A9 mRNA

5.1 引物設(shè)計(jì)及合成

利用生物信息學(xué)和參考文獻(xiàn)獲取基因序列；運(yùn)用Primer Premier 6.0 軟件，并參照有關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物。

引物序列如下（見表1）：

表1 S100A9 引物序列

5.2 逆轉(zhuǎn)錄

在無菌通風(fēng)條件下按RNeasy mini kit74104 試劑盒說明書提取外周血淋巴細(xì)胞中總RNA，置于冰上，美國Thermo fisher 公司的NanoDrop 2000/2000c紫外可見分光光度計(jì)檢測總RNA。OD260/OD280 在1.9 到2.1 之間者為合格品，取1μL 于電泳槽內(nèi)跑RNA 膠，RNA 未降解樣品繼續(xù)用于逆轉(zhuǎn)錄。以500ng 總RNA 為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First strand cDNA synthesis kit#1622 說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，采用隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄細(xì)胞內(nèi)mRNA，使之成為cDNA。設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃孵育5min，然后42℃孵育60min。70℃5min 終止反應(yīng)。

5.3 RT-PCR

反轉(zhuǎn)錄完成后，用2μl cDNA 配制Real-time PCR 體系，按SYBR Premix Ex Taq 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。每個(gè)樣本做三個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)液配制完成后，離心混勻后置于熒光定量PCR 儀器上按照下列條件進(jìn)行 PCR 反應(yīng)：第一步：95℃ 30s（預(yù)變性）×1循環(huán)→第二部：PCR 反應(yīng)（95℃5s，60℃30s，72℃30s）×40 循環(huán)→第三步：融解反應(yīng)（95℃1min，55℃30s，95℃30s）×1 循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，儀器自動采集并收集熒光信號。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α=0.05，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot灰度分析時(shí)，為使不同凝膠電泳組的結(jié)果更具有可比性，統(tǒng)一將同組蛋白相對含量的最大值標(biāo)準(zhǔn)化為1，組間比較采用t 檢驗(yàn)或one-way ANOVA 檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 S100A9 Real Time PCR 結(jié)果

Real Time PCR 結(jié)果分析：Real Time PCR 分析的表達(dá)采用比較2-△△Ct值的相對定量方法推算樣本中的S100A9 的cDNA 模板起始量。對照組選擇正常人外周血淋巴細(xì)胞組；分析S100A9 基因在散發(fā)鼻咽癌組、高癌家系鼻咽癌組外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)。Real Time PCR 反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)果如（圖1、圖2）：從最大基線后開始，目的基因的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)指數(shù)增長期和平臺期，說明有產(chǎn)物擴(kuò)增；溶解曲線顯示是單一的峰，說明所設(shè)計(jì)的引物有較高的特異性，擴(kuò)增出單一產(chǎn)物。比較三組中S100A9 mRNA 差異，結(jié)果顯示S100A9 mRNA 在22 例高癌家系鼻咽癌、散發(fā)鼻咽癌、正常人外周血中的△Ct 分別為-3.886±1.663；-3.421±1.110；-4.031±1.586。差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.363），見表 2。

圖1 熒光定量PCR 檢測S100A9 基因在正常組、散發(fā)組、高癌組中的表達(dá)擴(kuò)增曲線圖

圖2 熒光定量PCR 檢測S100A9 基因在正常組、散發(fā)組、高癌組中的表達(dá)溶解曲線圖

表2 高癌家系外周血淋巴細(xì)胞中S100A9 mRNA 的△Ct 值比較（）

表2 高癌家系外周血淋巴細(xì)胞中S100A9 mRNA 的△Ct 值比較（）

F 值 =1.030，P 值 =0.363★注：★表示三組間方差分析比較P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別 例數(shù) S100A9 mRNA 相對表達(dá)量高癌家系鼻咽癌 22 -3.886±1.663散發(fā)鼻咽癌 22 -3.421±1.110正常人 22 -4.031±1.586

2 S100A9 蛋白在人外周血單個(gè)核細(xì)胞及組織中的表達(dá)

S100A9 蛋白在高癌家系鼻咽癌組、散發(fā)鼻咽癌組、正常人組外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)分別為0.518±0.353；0.481±0.344；0.245±0.202，方差不齊（P=0.005），選擇基于方差不齊的Welch 法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019）。選擇基于方差不齊的Dunnett’s T3 法多重比較：高癌家系鼻咽癌組與正常人組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020）；散發(fā)鼻咽癌組與正常人組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）；高癌家系鼻咽癌組與散發(fā)鼻咽癌組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.745)，見圖3、表3。

圖3 外周血淋巴細(xì)胞中高癌家系組、散發(fā)組與正常人組蛋白條帶

表3 高癌家系外周血淋巴細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量比較（）

表3 高癌家系外周血淋巴細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量比較（）

F 值 =3.459，P 值 =0.019★注：★表示三組間方差分析比較P＜0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別 例數(shù) S100A9 蛋白相對表達(dá)量高癌家系鼻咽癌 22 0.518±0.353散發(fā)鼻咽癌 22 0.481±0.344正常人 22 0.245±0.202

討論

1965 年，MORE 從牛的大腦組織中首次分離出一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白混合物，因該類蛋白能夠100%溶解在飽和硫酸銨（ammoniusulfate）中性溶液中，故稱之為S100 蛋白[7]。S100A9 為相對分子質(zhì)量較小（13×103）的蛋白，兩端為氨基末端 EF-1 和羧基末端EF-2 手型結(jié)構(gòu)，中間為鉸鏈區(qū)，組成4 個(gè)α-螺旋，形成螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)配基結(jié)構(gòu)。羧基端結(jié)合位點(diǎn)常由12 個(gè)氨基酸組成，氨基端結(jié)合位點(diǎn)常由14 個(gè)氨基酸組成，呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)。羧基端的Ca2+親和力是氨基末端結(jié)合位點(diǎn)的100 多倍。S100A9 的羧基末端區(qū)域主要包括親水的殘基、甘油和脯氨酸殘基，易變形和錯亂，不能形成一個(gè)穩(wěn)定的次級結(jié)構(gòu)。S100A9 晶體結(jié)構(gòu)包括4 個(gè)二聚體(DIM1、DIM2、DIM3、DIM4)。目前發(fā)現(xiàn) S100 蛋白家族為小分子量蛋白組成的鈣結(jié)合蛋白家族, 共有22 個(gè)成員，其中16 個(gè)成員定位于1 號染色體長臂2 區(qū) 1 帶（1q21）[8]。

目前S100A9 分子蛋白研究發(fā)現(xiàn)廣泛參與機(jī)體各方面調(diào)控，鈣結(jié)合蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信息調(diào)控，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，S100A9 蛋白分子與機(jī)體腫瘤生長、分化及轉(zhuǎn)移潛能具有關(guān)聯(lián)性。Xiong TF、Wagner NB 等基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)S100A9 蛋白和黑色素瘤侵襲性及轉(zhuǎn)移相關(guān)，S100A9 分子蛋白檢測有利于黑色素瘤早期篩查[9，10]。Raffat, MA 研究發(fā)現(xiàn) S100 家族與OSCC（口腔鱗狀細(xì)胞癌）具有相關(guān)性，可以成為OSCC篩查的潛在指標(biāo)[11]。Arora A 等[12]發(fā)現(xiàn)重組S100A8/S100A9 蛋白可以促進(jìn)整合素信號依賴性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲。Hermani A 等[13]研究發(fā)現(xiàn)S100A8/A9誘導(dǎo)NF-NB 活化，p38 和 p44/42 磷酸化增加 MAP激酶，促使前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Laouedj M 等[14]研究發(fā)現(xiàn)S100A9 在急性髓性白血病（AML）存在高表達(dá)情況，S100A9 與 Toll 樣受體 4（TLR4）的結(jié)合促進(jìn)了p38 絲裂原活化蛋白激酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2 以及Jun N 端激酶信號通路的激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，對于腫瘤預(yù)后有重要影響。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌病理組織及鼻咽癌不同分化鼻咽癌細(xì)胞S100A9 表達(dá)存在差異。S100A9 蛋白分子濃度能夠促進(jìn)CNE1、CNE2 細(xì)胞侵襲性及轉(zhuǎn)移潛能[15]。李美香等[16]研究發(fā)S100A9 在NPC 間質(zhì)中高表達(dá)與NPC的分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。本課題組曾發(fā)現(xiàn)鼻咽癌高癌家系外周淋巴細(xì)胞S100A9 存在差異性表達(dá)。同時(shí)也對鼻咽癌其他分子蛋白標(biāo)記物進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn) F-肌動蛋白 α 亞基（CAPZA1）、Prohibitin 蛋白在鼻咽癌高癌家系存在差異性表達(dá)[17，18]。

本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌高癌家系癌患者和散發(fā)性鼻咽癌癌患者mRNA 表達(dá)水平存在差異，但其P＞0.05，差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鼻咽癌高癌家系癌患者、散發(fā)性鼻咽癌癌患者、正常對照組S100A9 分子蛋白表達(dá)存在明顯差異性，鼻咽癌高癌家系表達(dá)明顯高于其他組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)結(jié)果表明S100A9 有望成為鼻咽癌高癌家系篩查指標(biāo)。