鄭樹濤，劉 清，劉 濤，楊麗菲，張琪琪，韓秀娟，阿爾孜古麗·吐爾遜，盧曉梅

(1新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院；2省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室，烏魯木齊830011；3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，烏魯木齊830054)

食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)是最常見的上消化道惡性腫瘤之一，中晚期患者5年生存率不足10%。ESCA有食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)兩種組織病理學(xué)分型。EAC多見于歐美，ESCC為亞洲高發(fā)[1]。食管癌的發(fā)生與環(huán)境因素和飲食習(xí)慣等密切相關(guān)[2]，多數(shù)就診的患者確診時已處于晚期。晚期食管癌由于失去了最佳的手術(shù)治療機會，主要采用化療/靶向治療方案。對于晚期的食管癌患者，化療與靶向治療效果極為有限、導(dǎo)致復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率偏高，致使食管癌患者總體預(yù)后較差，5年生存率不足20%[3]。因此，在食管鱗癌中尋找新的治療靶點[4]和探索新的治療方法[5-6]顯得尤為重要。

免疫治療已成為繼靶向治療之后，腫瘤治療領(lǐng)域的最有希望的療法[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境對食管癌患者的免疫治療起著重要的調(diào)控作用[8]。在食管鱗癌微環(huán)境中，存在大量的M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)的浸潤[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，M2型TAMs浸潤密度高的ESCC患者其總生存要比浸潤密度低的患者總生存差[9]；且源于M2型TAMs的促炎細胞因子白介素1β(IL-1β)能促進食管鱗癌細胞的遷移和浸潤[10]，提示IL-1β作為促炎細胞因子能夠增加食管癌細胞的惡性細胞學(xué)行為。但IL-1β在ESCC細胞中對細胞程序性細胞死亡1配體1(PD-L1，又稱為CD274)的表達調(diào)控尚不明確。PD-L1作為重要的免疫檢查點分子，其表達狀態(tài)在腫瘤的免疫治療中起著重要的作用。本研究擬分析IL-1β對ESCC細胞的PD-L1表達調(diào)控作用并明確其臨床意義，探討IL-1β能否在食管癌免疫治療中作為一個干預(yù)靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析 運用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)[11]和TIMER(Tumor Immune Estimation Resource)[12]數(shù)據(jù)庫分析IL-1β和PD-L1在人ESCA中的表達水平及預(yù)后意義。

1.2 細胞培養(yǎng) 食管鱗癌細胞系KYSE30(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈)在37℃，5%CO2條件培養(yǎng)，含10%胎牛血清(FBS)，青霉素(100 IU/mL)及鏈霉素(100 IU/mL)的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。所有的細胞實驗均在細胞對數(shù)生長期時進行。重組的人源化IL-β蛋白購自義翹神州公司(貨號：10139-H07E；義翹神州公司;北京)，其處理細胞的工作濃度為20 ng/mL。

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)運用Trizol法提取細胞總RNA，NanoDrop ND-2000超微量分光光度計檢測總RNA的純度和濃度。Invitrogen?公司的Super Script?III逆轉(zhuǎn)錄酶(貨號：18080044；ThermoScientific；美國)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Takara TB Green Fast qPCR Mix熒光定量qPCR試劑盒(貨號：RR430B；TaKaRa;中國大連)進行實時熒光定量PCR檢測。PD-L1上游引物：5-CCTACTGGCATTTGCTGAACGCAT-3;PD-L1下游引物：5-ACCATAGCTGATCATGCAGCGGTA-3；β-actin上游引物：5-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3；β-actin下游引物：5-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3；引物的退火溫度為55℃。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，擴增40個循環(huán)；72℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算PD-L1 mRNA的相對表達量。

1.4 免疫印跡 采用RIPA蛋白裂解液進行細胞總蛋白的提取，并用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進行總蛋白的濃度測定。將總蛋白在8%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行蛋白質(zhì)電泳；待蛋白條帶跑到膠底，100 V恒壓轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。含5%的TBST脫脂牛奶中封閉4℃過夜或室溫2 h，TBST緩沖液洗滌3遍，每遍5 min；之后進行兔抗人PD-L1(稀釋度1∶1 000;貨號:66248-1-Ig,Proteintech,武漢)和兔抗人β-actin(1:1 000;貨號:TA-09;ZSGB-BIO,北京)和兔抗人GAPDH(稀釋度1∶1 000;貨號:10494-1-AP,Proteintech,武漢)抗體一抗孵育4℃過夜或室溫2 h；TBST緩沖液洗滌3遍，每遍5 min；進行堿性磷酸酶AP標記的二抗(貨號：SA00002-2；Proteintech,武漢)孵育室溫1 h，TBST緩沖液洗滌3遍，每遍5 min；之后堿性磷酸酶底物顯色試劑盒(BCIP/NBT)(貨號：002209，Invitrogen，美國)進行顯色。

1.5 免疫熒光 將處于對數(shù)生長期的食管鱗癌細胞接種在激光共聚焦顯配套專用微皿(貨號：801001；NEST公司；無錫)上，待細胞貼壁后，用濃度為20 ng/mL重組的人源化IL-β蛋白(貨號：10139-H07E；義翹神州公司;北京)刺激1 h，以未處理的細胞作為對照組。用pH=7.0～7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min；然后用4%的多聚甲醛溶液進行室溫固定20 min，然后PBS洗滌3次，每次3 min；然后用0.5%的Triton?X-100 PBS進行通透20 min；然后PBS洗滌3次，每次3 min；然后加入正常山羊血清進行室溫封閉20 min，然后PBS洗滌3次，每次3 min；然后兔抗人PD-L1(稀釋度1:1 000;貨號:66248-1-Ig,Proteintech,武漢)一抗孵育4℃過夜。然后PBS洗滌3次，每次3 min；在暗盒中加入羊抗兔IgG(H+L),Alexa Fluor?488熒光標記二抗(稀釋度2μg/mL;貨號：A27034；Thermo Scientific；美國)，室溫孵育30 min，然后PBS洗滌3次，每次3 min；然后加入DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)熒光染料(貨號：C0065；Solarbio；北京)進行細胞核染色。之后，進行熒光倒置顯微鏡觀察采集圖片。

1.6 抗體芯片 采用RIPA蛋白裂解液進行細胞總蛋白的提取，并用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進行總蛋白的濃度測定。將實驗組和對照組總蛋白分別用Cy5和Cy3兩種不同顏色的熒光分子分別標記兩個樣品，洗去多余的標記分子，與抗體芯片(芯片型號：AAH-JAKSTAT-1-8;RayBiotech,廣州)雜交孵育，掃描分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有的計量資料以均值±標準差（±s）表示，并進行正態(tài)分布檢驗，每個試驗至少進行2～3次，符合正態(tài)分布的兩組間的數(shù)據(jù)比較獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用卡方檢驗，預(yù)后采用Kaplan-Meier生存曲線分析和對數(shù)秩檢驗分析方法，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β和PD-L1在人食管癌中的表達水平及預(yù)后意義 通過分析GEPIA數(shù)據(jù)庫中收錄的有關(guān)IL-1β和PD-L1的mRNA在ESCA中表達的數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)相比在癌旁正常組織，IL-1β和PD-L1的mRNA在ESCA組織中上調(diào)表達，但PD-L1(CD274)不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)(圖1A)。運用另一個數(shù)據(jù)庫TIMER，分析IL-1β和PD-L1的mRNA在ESCA中的表達，發(fā)現(xiàn)在TIMER數(shù)據(jù)庫中，相比在癌旁正常組織，IL-1β和PD-L1的mRNA在ESCA組織中均呈顯著性上調(diào)表達(P＜0.001)(圖1B)。通過這兩種不同的數(shù)據(jù)庫分析，PD-L1的結(jié)果是一致的，即PD-L1的mRNA在ESCA組織中顯著性上調(diào)表達。而IL-1β只在TIMER數(shù)據(jù)庫中呈顯著性上調(diào)表達，但是在GEPIA數(shù)據(jù)庫中雖然上調(diào)但不具有統(tǒng)計學(xué)差異。分析GEPIA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，上調(diào)的IL-1β和PD-L1的mRNA與ESCA患者不良預(yù)后有統(tǒng)計學(xué)趨勢但是不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.061與0.052)(圖1C和1D)。運用Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)IL-1β和PD-L1的mRNA表達之間具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(R2=0.194;P=0.008 1)(圖1E)，提示ESCA組織中IL-1β和PD-L1的mRNA表達 之間具有統(tǒng)計學(xué)正相關(guān)。

圖1 生物信息學(xué)分析IL-1β和PD-L1 mRNA在食管癌中的表達水平及預(yù)后意義

2.2 IL-1β上調(diào)食管鱗癌細胞系KYSE30細胞的PD-L1表達 在體外食管鱗癌細胞系水平，運用重組的人源化IL-β蛋白刺激食管鱗癌細胞系KYSE30，運用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，PD-L1的mRNA在重組的人源化IL-β蛋白短時間處理下表達迅速升高，相比對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)(圖2A)。在蛋白水平，運用免疫印記和免疫熒光發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌細胞系KYSE30在重組的人源化IL-β蛋白刺激下，其PD-L1蛋白表達上調(diào)(圖2B和2C)。該結(jié)果表明，重組人源化IL-β蛋白刺激食管癌細胞后能夠顯著性上調(diào)食管癌細胞的PD-L1蛋白表達。

圖2 重組的人IL-1β蛋白刺激食管鱗癌細胞系KYSE30后上調(diào)PD-L1的mRNA和蛋白表達

2.3 IL-1β激活STAT3信號通路 為了明確重組的人源化IL-β蛋白如何上調(diào)PD-L1蛋白表達，本研究運用抗體芯片技術(shù)篩選了食管癌細胞食管鱗癌細胞系KYSE30在重組的人源化IL-β蛋白刺激與非刺激下，差異信號通路的篩選，發(fā)現(xiàn)相比IL-β蛋白未刺激，KYSE30在重組的人源化IL-β蛋白刺激下其胞內(nèi)的STAT3信號通路被激活(圖3A)。運用免疫印跡，驗證了抗體芯片篩選的結(jié)果(圖3B)，表明重組的人源化IL-β蛋白通過激活STAT3信號通路來上調(diào)PD-L1的表達。

圖3 抗體芯片篩選IL-1β刺激食管癌鱗癌細胞系KYSE30后激活的信號通路

3 討論

在本研究中，通過分析GEPIA[11]和TIMER[12]數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)相比癌旁正常組織，IL-β和PD-L1的mRNA在ESCA組織中顯著性上調(diào)；且上調(diào)的IL-β和PD-L1的mRNA與ESCA患者的總生存具有統(tǒng)計學(xué)趨勢不具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。在體外食管鱗癌細胞系水平，IL-β能夠通過激活STAT3信號通路上調(diào)食管癌細胞的PD-L1表達。本研究結(jié)果提示，IL-β可能作為食管鱗癌抗PD-L1抗體免疫治療的一個聯(lián)合干預(yù)靶標。因此，本研究對食管鱗癌的免疫治療具有一定的理論參考價值。

在正常生理狀態(tài)下，組織細胞表面的PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后可抑制T細胞的過度增殖活化，維持機體正常的免疫平衡。在腫瘤發(fā)生時，腫瘤細胞表面過度表達的PD-L1可阻止T細胞的活化及增殖，進行負性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)T細胞凋亡，使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸進而促進腫瘤增長[13]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-β能夠通過激活STAT3信號通路上調(diào)食管癌細胞的PD-L1表達；提示IL-β可以作為下調(diào)PD-L1過度表達的一個潛在干預(yù)靶標。在食管癌腫瘤微環(huán)境中，過度表達的IL-β從何而來？前期實驗，通過體外細胞共培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)IL-β主要來源于M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞，而食管鱗癌細胞本身分泌的IL-β極其少[10]。因此，在食管鱗癌微環(huán)境中M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞通過分泌大量的IL-β從而促進食管鱗癌細胞高表達PD-L1，從而協(xié)助腫瘤細胞免疫逃逸。

在本研究中，通過分析GEPIA和TIMER數(shù)據(jù)庫中IL-β和PD-L1的mRNA表達數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，盡管相比癌旁正常組織，IL-β和PD-L1的mRNA在ESCA組織中顯著性上調(diào)；但是顯著上調(diào)的IL-β和PD-L1的mRNA與ESCA患者的總生存只有統(tǒng)計學(xué)趨勢但并不具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。這與大多數(shù)PD-L1與食管鱗癌預(yù)后相關(guān)報道不一致[14-15]。導(dǎo)致不一致的原因可能在于：這些數(shù)據(jù)庫中收錄的ESCA包括了ESCC和EAC；而ESCC和EAC是兩種病理生理發(fā)病機制完全不同的兩種腫瘤[16]，因此IL-β和PD-L1的mRNA與ESCA患者的總生存只有統(tǒng)計學(xué)趨勢。此外，檢測方法的不同也會導(dǎo)致最終結(jié)果的不同。這兩個數(shù)據(jù)庫中收錄的都是RNA測序(RNA-Seq)的數(shù)據(jù)，即都是mRNA表達水平；而其他研究運用的都是免疫組化技術(shù)[17]檢測食管鱗癌組織的IL-β和PD-L1。在本研究中，發(fā)現(xiàn)IL-β能夠激活STAT3信號通路，這與Wang等[18]的研究報道是相一致的，其研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達依賴于STAT3信號通路[19]。但是激活的STAT3信號通路如何上調(diào)PD-L1表達的調(diào)控機制目前仍不清楚，需要進一步研究。在M2型巨噬細胞中IL-β如何被調(diào)控的尚不清楚。最近的一份研究可能解釋了M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞如何調(diào)控IL-β分泌的。Zhang等[20]通過研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸氧化促進了M2型巨噬細胞分泌IL-β從而促進食管癌細胞的遷移。

綜上所述，本研究從細胞因子角度解釋了食管鱗癌微環(huán)境中M2型巨噬細胞如何通過上調(diào)食管癌細胞的PD-L1表達來協(xié)助食管癌細胞發(fā)生免疫逃逸的機制，這對食管癌抗PD-L1抗體治療中協(xié)同抑制靶標探討具有一定的參考價值。