張琪琪，劉 清，鄭樹濤，劉 濤，楊麗菲，韓秀娟，盧曉梅

（1新疆醫(yī)科大學臨床醫(yī)學研究院，2省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室，烏魯木齊830011；3新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，烏魯木齊830054）

食管癌（esophageal cancer，EC）是最常見的上消化道惡性腫瘤之一，男性多于女性，其發(fā)病年齡多在40歲以上。報道顯示全球食管癌發(fā)病率和死亡率分別位列第7位和第6位。國際癌癥研究機構（IARC）報道2018年有57.2萬人新診斷為食管癌，同時有50.9萬人死于食管癌，據WHO數(shù)據，中國食管癌患病率和死亡率排在全球第五位[1]。食管癌的主要組織學類型包括食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）、食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。在我國，食管癌以鱗狀細胞癌為主，其術后5年生存率僅為5%～20%[2]，患者就診時常常已是晚期，是導致食管癌死亡率居高不下的重要原因。食管癌的臨床治療方法包括手術治療、放療、化療、內窺鏡治療、中藥抗腫瘤治療、姑息治療等。雖然這些傳統(tǒng)的治療方法已在臨床應用多年，但食管癌患者的預后仍較差[3-4]。因此，尋找新的食管癌診斷及治療靶點，從而提高食管癌的早診早治非常重要。

信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）是具有轉錄活性的癌基因，廣泛參與各項細胞生理及病理學過程，包括惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲轉移、免疫調節(jié)等[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在食管癌患者中陽性率較高，與腫瘤分化程度、TNM分期有一定的關系，STAT3陽性表達患者的中位生存時間明顯縮短，可作為判斷患者預后的潛在因子[6-7]。STAT3被激活后可以產生免疫抑制作用，抑制STAT3的過度表達不僅能阻斷腫瘤細胞的過度增殖，還可以增強機體對腫瘤的免疫能力。近年來，STAT3靶向抑制劑WP1066、S3I-201（NSC 74859）在減緩腫瘤進展和增強化療藥物敏感性中的作用取得初步進展，但其機制有待進一步探索。因此，本研究旨在通過構建ESCC人源腫瘤異種移植模型（patient-derived tumor xenograft，PDX），觀察STAT3小分子抑制劑NSC74859的抗腫瘤作用，并進一步研究其抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 NSC74859，Cat.#：HY-15146/CS-0512，CAS：501919-59-1，批號Lot#：10830，分子量：365.36，廠家：MCE。Corn oil（溶媒），Cat.#：HYY1888/CS-0040437，CAS：8001-30-7，批 號Lot#：56297，廠家：MCE。BCA蛋白定量試劑盒購自Solarbio公司。STAT3、p-STAT3抗體購自Cell Signaling Technology公司。免疫組織化學（EnVision兩步法）試劑盒、DAB顯色劑購自于北京中杉金橋生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 利用UALCAN分析STAT3在腫瘤及正常樣本中的表達UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是一個全面的、交互式的癌癥組學數(shù)據分析網絡資源。它建立在PERL-CGI上，使用javascript和CSS提供高質量的圖形。UALCAN包含TCGA、MET500和CPTAC癌癥組學數(shù)據。

1.2.2 實驗動物 BALB/c nude小鼠，雌性，9～10周（腫瘤組織接種時的小鼠周齡），體重16.8～20.7 g。購自北京安凱毅博生物技術有限公司，動物合格證編號：1103301911000940。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級。

1.2.3 實驗動物飼養(yǎng)室的環(huán)境條件 實驗動物均飼養(yǎng)于恒溫恒濕的獨立通風盒內，飼養(yǎng)室溫度21.5～23.2℃，濕度48%～62%，10～20次/小時換氣，晝夜明暗交替時間12 h/12 h；持續(xù)供給鈷60放射滅菌鼠全價顆粒飼料，不限量自由攝取，飲用自來水（高壓蒸汽滅菌后使用），飲水瓶不間斷供水，自由攝取。飼養(yǎng)鼠盒是聚砜鼠盒，高壓滅菌后使用，規(guī)格為325 mm×210 mm×180 mm；墊料是高壓滅菌玉米芯，每盒5只動物，籠卡上標明實驗編號、實驗開始時間、課題負責人、實驗人員、動物來源、組別和動物號等；實驗動物打耳號進行標記。

1.2.4 ESCCPDX動物模型的建立 經過醫(yī)院倫理委員會審批（審批號:20160218-123），從醫(yī)院獲得2例新鮮患者ESCC腫瘤組織，命名為ES0172模型和ES0195模型。將腫瘤組織切成直徑為2～3 mm的瘤塊，并在生物安全柜中接種于BALB/c nude小鼠右前肩胛處皮下（F0代）。在小鼠體內進行傳代移植3次（F1-F3代）。

1.2.5 動物分組及給藥及腫瘤體積測量及實驗觀察第F4代時，當腫瘤平均體積達到150 mm3左右時，根據腫瘤大小將小鼠隨機分為兩組，NSC74859治療組及溶媒對照組，每組5只PDX小鼠。NSC74859治療組予以NSC74859 5 mg/kg腹腔注射，每天1次，連續(xù)注射7 d，溶媒對照物組予以等體積溶媒注射，每天1次，連續(xù)注射7 d。腫瘤接種后，常規(guī)監(jiān)測包括腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。每周稱量每組實驗小鼠體重2次，每周2次使用游標卡尺測量皮下腫瘤組織的最長徑（a）與最短徑（b），計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。給藥28 d后實驗動物脫頸椎處死，摘取腫瘤組織，并稱量腫瘤濕重。腫瘤體積計算公式如下：腫瘤體積（mm3）=（a×b2）×0.5。結果 判斷標準：相對腫瘤抑制率TGI（%）：TGI=1-T/C（%）。T/C%為相對腫瘤增殖率，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的相對腫瘤體積（RTV）。計算公式如下：T/C%=TRTV/CRTV×100%（TRTV：治療組平均RTV；CRTV：對照組平均RTV；RTV=Vt-V0，V0為分組時該動物的瘤體積，Vt為治療后該動物的瘤體積）。

1.2.6 Western blot分析 用RIPA裂解液（包含1%的蛋白酶抑制劑）提取腫瘤組織的總蛋白，然后用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。用10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白，然后轉印跡到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封膜2 h后，用一抗在4℃下于搖床上緩慢孵育過夜。次日洗膜后用二抗在室溫下于搖床上緩慢孵育2 h。洗膜后用Novex?AP顯色底物（BCIP/NBT）顯色，觀察蛋白條帶。使用ImageJ軟件（1.8.0,USA）對蛋白條帶進行半定量分析。STAT3濃度稀釋比為1:1 000，p-STAT3Y705濃度稀釋比為1:2 000。

1.2.7 免疫組織化學染色分析 對石蠟包埋的腫瘤組織進行蘇木精伊紅（HE）染色和免疫組織化學染色（IHC）。組織樣品經脫蠟后在梯度酒精里進行水化，然后用3%H2O2去除內源性過氧化物酶對染色的影響。經檸檬酸緩沖液處理后用山羊血清在室溫下封閉30 min。然后與一抗在4℃下孵育過夜。次日用二抗（酶偶聯(lián)山羊抗兔或抗鼠）在37℃下孵育60 min。最后用DAB顯色液進行顯色，用蘇木素進行復染。p-STAT3Y705濃度稀釋比為1:200。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理。若數(shù)據符合正態(tài)分布，計量資料以（±s）表示，用t檢驗進行兩組之間單因素分析。非正態(tài)分布計量資料采用Mann-Whitney U秩和檢驗分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 STAT3在腫瘤及正常樣本中的表達 利用UALCAN癌癥組學數(shù)據分析網絡資源分析了STAT3在腫瘤及正常樣本中的表達。由分析結果可知，STAT3在多個腫瘤中高表達，如宮頸癌（CESC）、膽管癌（CHOL）、食管癌（ESCA）、多形性膠質母細胞瘤（GBM）、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、胃癌（SATD）等，但在肺鱗狀細胞癌（LUSC）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、結腸腺癌（COAD）、腎嫌色細胞癌（KICH）、腎透明細胞癌（KIRC）等低表達（圖1）。其中，STAT3在ESCA中的表達最高，平均值為6.82（圖2）。

圖1 STAT3在腫瘤及正常樣本中的表達

圖2 STAT3在腫瘤中的表達

2.2 ESCC PDX模型臨床背景信息 ES0172模型和ES0195模型均為食管鱗狀細胞癌。ES0172模型的患者為男性，62歲，臨床分期：T2N1M0,IIB，腫瘤分級：II-III，分型：髓質型；ES0195模型的患者為女性，58歲，臨床分期：T3N0M0，IIA，腫瘤分級：II-III，分型：潰瘍型。

2.3 NSC74859對ESCC PDX模型小鼠腫瘤生長的抑制作用 ES0172模型在給藥開始后第21天起NSC74859治療組與溶媒對照組在腫瘤體積上出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，ES0195模型在給藥開始后第16天起NSC74859治療組與溶媒對照組在腫瘤體積上出現(xiàn)統(tǒng)計學差異。ES0172模型在給藥開始后第28天時，溶媒對照組小鼠平均腫瘤體積為1 032.68 mm3，相對腫瘤體積（RTV）為889.99 mm3；NSC74859治療組小鼠平均腫瘤體積為586.91 mm3，相對腫瘤體積（RTV）為445.38 mm3；相對腫瘤抑制率TGI（%）為49.96%，與溶媒對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P=0.020）。ES0195模型在給藥開始后第26天時，溶媒對照組小鼠平均腫瘤體積為660.43 mm3，相對腫瘤體積（RTV）為517.32 mm3；NSC74859治療組小鼠平均腫瘤體積為382.27 mm3，相對腫瘤體積（RTV）為238.58 mm3；相對腫瘤抑制率TGI（%）為53.88%，與溶媒對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P=0.010）（表1、2）。在ES0172模型中，NSC74859治療組小鼠平均腫瘤重量為484.22 mg，溶媒對照組小鼠平均腫瘤重量為855.80 mg，治療組與對照組相比下降了約43.42%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.041）；在ES0195模型中，NSC74859治療組小鼠平均腫瘤重量為228.90 mg，溶媒對照組小鼠平均腫瘤重量為533.74 mg，治療組與對照組相比下降了約57.11%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.044）（圖3）。

表1在ES0172模型中兩組腫瘤體積對比（mm3，±s）

表1在ES0172模型中兩組腫瘤體積對比（mm3，±s）

注：與溶媒對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

時間給藥開始后0天給藥開始后4天給藥開始后7天給藥開始后11天給藥開始后14天給藥開始后18天給藥開始后21天給藥開始后25天給藥開始后28天NSC74859治療組141.53±9.11 170.53±10.57 251.74±23.66 253.58±32.93 336.96±45.52 421.44±71.72 438.86±84.13*535.42±92.67**586.91±108.55*溶媒對照組142.69±6.41 175.88±10.66 285.20±40.08 315.85±43.90 402.88±33.68 588.64±59.76 730.33±71.34 934.86±107.67 1032.68±113.66

2.4 p-STAT3在NSC74859治療組和溶媒對照組中的表達 在ES0172模型和ES0195模型中，運用Western blot分析p-STAT3在NSC74859治療組中的表達水平顯著低于溶媒對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05，圖4）。運用免疫組織化學方法檢測了p-STAT3在NSC74859治療組和溶媒對照組中的表達，p-STAT3在NSC74859治療組呈陰性表達，在溶媒對照組中呈陽性表達（圖5）。

表2在ES0195模型中兩組腫瘤體積對比（mm3，±s）

表2在ES0195模型中兩組腫瘤體積對比（mm3，±s）

注：與溶媒對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

時間給藥開始后0天給藥開始后2天給藥開始后6天給藥開始后9天給藥開始后13天給藥開始后16天給藥開始后20天給藥開始后22天給藥開始后26天NSC74859治療組143.69±5.43 151.06±7.02 221.09±34.56 252.61±35.39 290.14±39.32 314.29±46.69*362.90±54.16*386.98±81.46*382.27±62.12**溶媒對照組143.11±4.69 174.47±10.46 340.93±54.19 383.79±64.45 412.74±66.49 472.33±62.07 566.68±65.59 613.28±68.39 660.43±64.63

圖3典型ESCC PDX小鼠及相對應的瘤體圖片

圖4 Western blot分析p-STAT3、STAT3在NSC74859治療組和溶媒對照組中的表達水平

圖5免疫組織化學檢測p-STAT3在NSC74859治療組和溶媒對照組中的表達（×400）

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及到多種信號途徑，這些信號途徑最終將集中于有限的轉錄因子。阻斷一個轉錄因子，即可阻斷調控該轉錄因子上游多種異常的腫瘤信號途徑。STAT3是IL-6/Jak、Src、EGFR等多個致癌性酪氨酸激酶信號通路匯聚的焦點，在多種腫瘤細胞和組織中都有激活。STAT3被激活后可誘導與細胞增殖、分化、凋亡密切相關基因的異常表達，在促進腫瘤細胞增殖、分化、細胞周期進程、轉移、血管生成、免疫抑制和化療耐藥等方面發(fā)揮重要作用[8]。因此，針對STAT3的靶向抑制劑有望成為治療惡性腫瘤的重要手段之一。本研究對STAT3小分子抑制劑NSC74859的體內抗腫瘤作用及其機制進行了研究。結果表明NSC74859能減輕ESCC腫瘤負荷，其抗腫瘤機制可能與下調STAT3的磷酸化水平有關。

目前研究較多的STAT3抑制劑按類別可以分為肽類、天然產物類以及通過計算機藥物虛擬篩選技術發(fā)現(xiàn)的小分子。NSC74859，作為STAT3的小分子抑制劑，其抗腫瘤作用已在多種腫瘤中被證實。有研究證明NSC74859通過抑制STAT3的激活，下調HIF-1α和血管內皮生長因子的表達，使食管鱗癌具有放射增敏作用[9]。人源腫瘤異種移植模型（PDX）已被開發(fā)用于將基礎研究轉化為臨床應用[10]。通過將患者的腫瘤組織直接移植到免疫缺陷鼠而建立的PDX模型在組織病理學、分子生物學和基因水平上保留了大部分原代腫瘤的特點，具有較好的臨床療效預測性，在臨床腫瘤的精準治療研究中發(fā)揮著不可替代的作用。目前，PDX模型已應用于多種腫瘤研究，特別是腫瘤耐藥研究[11-14]。本研究構建了ES0172和ES0195兩例ESCC PDX模型用于研究NSC74859的抗腫瘤效應，其結果更加貼近臨床，更真實有效。但由于負荷腫瘤的小鼠均為免疫缺陷的小鼠，因而PDX模型不能用于篩選免疫相關藥物如疫苗、免疫調節(jié)藥物。本研究檢測了PDX小鼠腫瘤組織中STAT3、p-STAT3的表達，結果顯示NSC74859顯著下調了STAT3的磷酸化水平，提示NSC74859抑制腫瘤的生長是通過下調STAT3的磷酸化實現(xiàn)的。有研究報道STAT3抑制劑NSC74859可有效延緩肛門鱗癌(ASCC)小鼠模型的腫瘤生長[15]，與本研究結果一致。

綜上所述，NSC74859通過下調STAT3的磷酸化對ESCCPDX模型腫瘤的生長產生抑制作用，這不僅將更加全面的評價NSC74859的抗腫瘤藥效，而且會為ESCC的藥物研究評估及篩選、癌癥患者的個體化治療提供良好的模型。