李泳潔，馬海平，吳建江，楊 龍，郭 海，王 江

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，烏魯木齊830054）

心肌缺血/再灌注損傷（Ischemia/reperfusion injure,I/RI）是臨床常見的病理生理過程，也是患者圍術(shù)期心臟不良事件發(fā)生和死亡的重要原因[1]。七氟醚后處理（Sevoflurane postconditionning,SPostC）已被證實(shí)可通過抑制細(xì)胞凋亡、減少活性氧（ROS）的生成、增加腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的含量和減少乳酸脫氫酶（LDH）含量，對(duì)心肌所發(fā)生的I/RI發(fā)揮良好的心肌保護(hù)作用，是極具希望的抗心肌損傷的治療手段[2]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。前期研究表明，缺 氧 誘 導(dǎo) 因 子-1α（Hypoxia-inducible factors-1α,HIF-1α）作為調(diào)控心肌低氧壞境下啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的始動(dòng)因子，是介導(dǎo)SPostC發(fā)揮心臟保護(hù)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)[3-4]。Jankauskas等[5]研究報(bào)道，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF）作為HIF-1α的下游因子，在心肌I/RI過程中同樣發(fā)揮重要的作用。在心肌組織中HIF-1α和MIF的表達(dá)水平有密切的相關(guān)性，MIF的表達(dá)隨著HIF-1α表達(dá)上調(diào)而增加[6]。但是HIF-1α/MIF信號(hào)軸在SPostC減輕心肌I/RI中發(fā)揮的具體作用尚不清楚。本研究通過建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，探討HIF-1α/MIF信號(hào)軸在SPostC對(duì)抗心肌細(xì)胞H/R損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器 大鼠心肌細(xì)胞（H9C2）細(xì)胞株（武漢普諾賽，中國(guó)）；缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）抗體（Abcam，美國(guó)），巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）抗體（Abcam，美國(guó)），腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）抗體（CST，美國(guó)），磷酸化AMPKα（p-AMPKα）抗體（CST，美國(guó)），山羊抗兔IgG（Abcam，美國(guó)），山羊抗小鼠IgG（Abcam，美國(guó)），β-Actin（義翹神州，中國(guó)）；HIF-1α抑制劑YC-1（Selleck，美國(guó)）；三磷酸腺苷（ATP）試劑盒（南京建成，中國(guó)），乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒（南京建成，中國(guó)），活性氧（ROS）試劑盒（南京建成，中國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)箱MIC1-101（Billupsrothenberg，美國(guó)）

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將心肌細(xì)胞H9C2分為對(duì)照組（NOR組）、缺氧/復(fù)氧組（H/R組）、七氟醚后處理組（SPostC組）、HIF-1α抑制劑組（YC-1組）。NOR組：CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)54 h，不做任何干預(yù)。H/R組：CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞置入三氣培養(yǎng)箱缺氧3 h/復(fù)氧3 h。SPostC組：CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞置入三氣培養(yǎng)箱缺氧3 h。復(fù)氧開始前七氟醚后處理15 min，隨后在CO2培養(yǎng)箱下繼續(xù)培養(yǎng)165 min。YC-1組：CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)24 h后，更換含10μmol/L YC-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。干預(yù)完成后將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱缺氧3 h。復(fù)氧開始前七氟醚后處理15 min，隨后在CO2培養(yǎng)箱下繼續(xù)培養(yǎng)165 min。缺氧/復(fù)氧處理方法如下：細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液，細(xì)胞長(zhǎng)至80%后，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗2遍，加入不含血清不含葡萄糖的改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（DMEM），再置入37℃、94%N2、5%CO2、1%O2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，即為缺氧處理；缺氧處理后棄去培養(yǎng)基，加入正常新鮮DMEM培養(yǎng)基，置入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，即為復(fù)氧處理。處理完畢后檢測(cè)下述指標(biāo)，每項(xiàng)檢測(cè)每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3 七氟醚后處理干預(yù)細(xì)胞 細(xì)胞在復(fù)氧開始前實(shí)施SPostC 15 min。具體步驟：使用七氟醚揮發(fā)罐，將揮發(fā)罐出氣口與便攜式培養(yǎng)箱進(jìn)氣端緊密連接，調(diào)節(jié)流量2 L/min，七氟醚濃度2.4%，持續(xù)10 min后，封閉進(jìn)氣端與出氣端。待處理細(xì)胞在充滿七氟醚的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)15 min后取出，并在CO2培養(yǎng)箱下繼續(xù)培養(yǎng)165 min。

1.4 LDH、ROS、ATP水平和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）活性檢測(cè) 分別收集NOR組、H/R組、SPostC組、YC-1組的細(xì)胞和上清培養(yǎng)液，檢測(cè)各組上清培養(yǎng)液中LDH含量以及細(xì)胞ROS、ATP和CCK-8活性，步驟均完全按照試劑盒和儀器說明書進(jìn)行。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取NOR組、H/R組、SPostC組、YC-1組細(xì)胞，用PBS緩沖液將細(xì)胞配成106個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液，取1 mL細(xì)胞懸液1 000 g離心10 min，將細(xì)胞重懸于500μL的Binding Buffer中，然后依次添加Annexin V-FITC和PI溶液各5μL，完全混合后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平。所有操作按儀器和試劑說明書進(jìn)行。

1.6 Western blot檢測(cè)HIF-1α、MIF、AMPKα和p-AMPKα蛋白水平 采用Western blot檢測(cè)NOR組、H/R組、SPostC組、YC-1組細(xì)胞中HIF-1α、MIF、AMPKα和p-AMPKα的蛋白表達(dá)水平。步驟如下：蛋白提取試劑提取各組細(xì)胞總蛋白，在樣品蛋白中添加上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，取30μg樣品蛋白上樣電泳。將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜裁剪成合適大小，電壓100 V，90 min電轉(zhuǎn)至PVDF膜后，于封閉液室溫封閉轉(zhuǎn)印膜1 h；加入一抗（1:1 000），4℃孵育過夜；再于二抗（1:1 000）中室溫孵育1 h。以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果比較 與NOR組相比，H/R組的細(xì)胞增殖百分比顯著降低；與H/R組相比，SPostC組的細(xì)胞增殖百分比明顯增加；與SPostC組相比，YC-1組的細(xì)胞增殖百分比顯著降低，經(jīng)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。與NOR組相比，H/R組的血清LDH含量顯著降低（P＜0.05）；與H/R組相比，SPostC組的血清LDH含量明顯增加（P＜0.05）；與SPostC組相比，YC-1組的血清LDH含量顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 4組細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果比較（±s，n=5）

表1 4組細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果比較（±s，n=5）

注：與NOR組相比，*P＜0.05；與H/R組相比，#P＜0.05；與SPostC組相比，△P＜0.05。

指標(biāo)CCK-8/%LDH/U/L NOR組100.04±6.22 113.821±18.47 H/R組83.00±4.98*201.63±28.90*SPostC組92.61±7.58*#129.54±14.20*#YC-1組81.78±4.98*#△254.20±52.45*#△F值10.18 12.39 P值0.000 0.002

2.2 4組細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較 NOR組、H/R組、SPostC組、YC-1組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為3.967±1.069、21.667±0.351、12.033±0.833、19.333±0.322。與NOR組相比，H/R組的細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加；與H/R組相比，SPostC組的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低；與SPostC組相比，YC-1組的細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加，經(jīng)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=371.2，P=0.000）。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖

2.3 4 組細(xì)胞ROS生成和ATP含量測(cè)定比較 含量測(cè)定結(jié)果顯示，H/R組的ROS生成高于NOR組；而SPostC組顯著降低了ROS生成；HIF-1α抑制劑YC-1組促進(jìn)了ROS生成（P＜0.05）。ATP含量檢測(cè)顯示，H/R組細(xì)胞ATP含量明顯降低于NON組；而SPostC組的ATP含量比H/R組顯著增加；與SPostC組相比，YC-1組ATP含量略有降低（P＜0.05）。見表2。

2.4 Western blot檢測(cè) 在心肌細(xì)胞H/R模型中，HIF-1α、MIF和p-AMPKα蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。與NOR組相比，H/R組的HIF-1α、MIF和p-AMPKα蛋白表達(dá)水平均呈低表達(dá)（P＜0.05）；與H/R組相比，SPostC組HIF-1α、MIF和p-AMPKα蛋白表達(dá)水平均呈高表達(dá)（P＜0.05）；與SPostC組相比，YC-1組的HIF-1α、MIF和p-AMPKα蛋白表達(dá)水平均呈低表達(dá)（P＜0.05）（見表3和圖2）。AMPKα的蛋白表達(dá)無明顯的變化趨勢(shì)。

表2 4組細(xì)胞ROS生成和ATP含量測(cè)定結(jié)果比較（±s，n=3）

表2 4組細(xì)胞ROS生成和ATP含量測(cè)定結(jié)果比較（±s，n=3）

注：與NOR組相比，*P＜0.05；與H/R組相比，#P＜0.05；與SPostC組相比，△P＜0.05。

指標(biāo)ATP濃度/（μmol/gprot）ROS熒光含量NOR組309.524±66.894 440.667±73.037 H/R組75.978±12.258*1 605.333±118.001*SPostC組199.969±31.854*#836.333±99.500*#YC-1組120.897±19.558*#△1 372.667±100.610*#△F值22.99 84.39 P值0.000 0.000

表3 4組細(xì)胞HIF-1α、MIF、AMPKα、p-AMPKα蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）

表3 4組細(xì)胞HIF-1α、MIF、AMPKα、p-AMPKα蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）

注：與NOR組相比，*P＜0.05；與H/R組相比，#P＜0.05；與SPostC組相比，△P＜0.05。

組別NOR組H/R組SPostC組YC-1組F值P值HIF-1α 0.569±0.007 0.888±0.038*1.191±0.043*#0.889±0.089*#△66.31 0.000 MIF 0.251±0.013 0.393±0.045*0.622±0.138*#0.426±0.071*#△12.85 0.000 AMPKα 0.551±0.016 0.545±0.033 0.529±0.063 0.575±0.062 14.67 0.000 p-AMPKα 0.311±0.078 0.405±0.062*0.668±0.130*#0.395±0.057*#△10.19 0.000

圖2 蛋白表達(dá)水平條帶圖

3 討論

本研究采用H9C2心肌細(xì)胞，建立心肌細(xì)胞H/R模型。參考Yu等[7]的前期研究及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇2.4%七氟醚和缺氧3 h/復(fù)氧3 h進(jìn)行模型建立，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞H/R后細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡明顯增加，提示心肌細(xì)胞H/R損傷模型建立成功。

本研究H/R組中HIF-1α、MIF和p-AMPKα的表達(dá)明顯降低，ATP生成減少，細(xì)胞凋亡和ROS、LDH含量顯著增加，但SPostC組的HIF-1α表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率的降低，LDH和ROS的含量減少，表明SPostC明顯改善心肌細(xì)胞H/R損傷，同時(shí)細(xì)胞活性和ATP生成也顯著增加，比H/R組較好地維持了心肌細(xì)胞的完整性，減少了細(xì)胞損傷。研究結(jié)果表明心肌細(xì)胞H/R損傷后，HIF-1α表達(dá)水平顯著減少，而SPostC能顯著激活HIF-1α的表達(dá)，增加細(xì)胞活性，表明HIF-1α在SPostC對(duì)抗心肌細(xì)胞H/R損傷過程中的重要作用,再次驗(yàn)證了HIF-1α作為SPostC介導(dǎo)心肌保護(hù)作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。

有研究表明，HIF-1α作為心肌內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的關(guān)鍵靶標(biāo)，缺氧情況下HIF-1α表達(dá)增加不但可調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈能量生成，還能夠減少線粒體來源的ROS，從而避免心肌細(xì)胞損傷[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α表達(dá)增加可以激活VEGF表達(dá)促血管生成信號(hào)，進(jìn)一步減少心肌梗死面積[9]。雖然以上研究都表明HIF-1α表達(dá)的增加能夠減輕心肌I/RI，但并未闡明HIF-1α發(fā)揮心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制。

巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）是一種多效炎癥細(xì)胞因子，由包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞產(chǎn)生[10]，在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11]。充足的證據(jù)表明，MIF參與了病理?xiàng)l件下的心功能調(diào)節(jié)，包括燒傷、糖尿病和缺血/再灌注損傷[12-13]。也有研究證實(shí)MIF在缺血預(yù)處理發(fā)揮心肌保護(hù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14]，缺血預(yù)處理通過介導(dǎo)MIF激活再灌注損傷救援激酶（RISK）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路，減少了心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡[15]、抑制ROS生成[16]和細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)，維持了內(nèi)皮細(xì)胞功能[17]，從而改善了心肌I/RI導(dǎo)致的心功能不全[18]。也有研究表明MIF通過抑制c-Jun N末端激酶（JNK）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]，并通過其抗氧化能力為心肌I/RI時(shí)提供心肌保護(hù)作用。本研究重點(diǎn)關(guān)注SPostC對(duì)抗心肌細(xì)胞H/R損傷時(shí)HIF-1α對(duì)MIF的影響，發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)增加后顯著上調(diào)MIF的表達(dá)，兩者呈正相關(guān)。因此認(rèn)為，MIF作為SPostC發(fā)揮心肌保護(hù)作用的關(guān)鍵。

研究通過對(duì)各組細(xì)胞Western blot檢測(cè)，H/R組中HIF-1α、MIF和p-AMPKα的表達(dá)均呈低表達(dá)；SPostC組中HIF-1α、MIF和p-AMPKα的表達(dá)均呈高表達(dá)；但是在YC-1組HIF-1α、MIF和p-AMPKα的表達(dá)均呈低表達(dá)。本研究在證實(shí)了SPostC通過介導(dǎo)HIF-1α發(fā)揮心肌保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證明了SPostC是通過上調(diào)HIF-1α/MIF信號(hào)軸發(fā)揮心肌保護(hù)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1α/MIF信號(hào)軸是介導(dǎo)SPostC減輕心肌細(xì)胞H/R損傷的重要靶標(biāo)，本研究使用了HIF-1α抑制劑YC-1，發(fā)現(xiàn)HIF-1α被抑制后，SPostC的保護(hù)作用消失，同時(shí)伴有MIF和p-AMPKα的表達(dá)水平下降。這說明在心肌細(xì)胞H/R損傷時(shí)，SPostC發(fā)揮作用是通過調(diào)控HIF-1α/MIF信號(hào)軸降低細(xì)胞凋亡，減少LDH和ROS含量，促進(jìn)ATP生成，減輕缺氧心肌細(xì)胞損傷。因此認(rèn)為，HIF-1α/MIF信號(hào)軸是作為SPostC發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。

綜上所述，上調(diào)HIF-1α/MIF信號(hào)軸的表達(dá)可能是SPostC發(fā)揮保護(hù)作用的內(nèi)在機(jī)制，HIF-1α/MIF信號(hào)軸是SPostC對(duì)抗心肌細(xì)胞H/R損傷的關(guān)鍵靶標(biāo)，在SPostC介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用中發(fā)揮著重要作用。但本研究只限于細(xì)胞水平，下一步還需通過離體和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HIF-1α/MIF信號(hào)軸在SPostC中的作用。