阿里旦·艾爾肯，買爾旦·賽力木，武 云

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊830054）

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是多種原因引起的一種臨床綜合癥，是肺動脈壓力升高超過一定界值導(dǎo)致的血流動力學(xué)和病理生理改變的機(jī)體變化，導(dǎo)致此種機(jī)體變化的機(jī)制是肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的異常增殖，最終導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，使肺血管阻力增加，可使患者右心衰竭致死亡，主要表現(xiàn)為肺血管阻力增高及右心衰竭，預(yù)后極差。其發(fā)病率大約為每年100～200萬，75%的患者集中在20～40歲[1]。隨著人們對PAH研究的深入，逐漸認(rèn)識到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在PAH致病機(jī)制中起著重要作用，ESR是肺血管重構(gòu)促進(jìn)肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制[2-3]。缺血-再灌注損傷、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)蛋白合成過多和其他合成屏障或物理、化學(xué)和遺傳等多種因素均可引發(fā)ERS[4-7]。線粒體融合基因2(Mitofusin 2，MFN2)具有促進(jìn)線粒體融合的功能，與線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能有著密切關(guān)系[2]。在哺乳動物中MFN2與Fzo家族蛋白是同源的大分子蛋白，具有促進(jìn)線粒體融合、細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞凋亡保護(hù)功能[8]，阻抑MFN2可使葡萄糖氧化、線粒體膜電位以及細(xì)胞呼吸下降[9]，而MFN2表達(dá)增強(qiáng)后，葡萄糖氧化及線粒體膜電位增加；MFN2還存在于線粒體相連的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)表面，維持線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的連接，因此MFN2可影響ERS。本研究通過建立大鼠肺動脈高壓的模型，采用已知化學(xué)分子伴侶4-苯基丁酸(4-Phenylbutyrate，4-PBA)抑制ERS，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體通路中關(guān)鍵因子MFN2的表達(dá)與PAH的關(guān)系，以期為治療PAH提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康雄性SPF級Wistar大鼠60只，大鼠體重為180～200 g，均采用新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心實驗動物科學(xué)研究部。動物許可證號：SYXK（新）2018－0001。本實驗的步驟均經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，許可證編碼：IACU-20140313005。

1.2 方法 動物模型制備按照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。采用隨機(jī)數(shù)字表將Wistar雄性大鼠進(jìn)行分組：正常對照組（無任何處理），PAH組（腹腔注射60 mg/kg野百合堿誘導(dǎo)建立PAH模型），PRE組（PAH誘導(dǎo)當(dāng)天開始每天使用4-PBA，持續(xù)4 w）和REV組（PAH誘導(dǎo)第3周每天使用4-PBA，持續(xù)2 w。4 w后，4組大鼠采用二氧化碳窒息后頸椎脫位處死，取下肺和心臟樣本，在0.9%的冷水中快速清洗。肺組織在液氮中快速冷凍并在－80°C下儲存，之后采用實時PCR分析。從右肺門取出的橫切組織保存在10%的福爾馬林中，采用蘇木精-伊紅染色。

1.3 主要試劑 98%純度的野百合堿（生產(chǎn)批號：1001084656，廠家：日本Sigma株式會社）、4-苯基丁酸（生產(chǎn)批號：1011210328，廠家：日本Sigma株式會社）、TRNzol RNA提取試劑（廠家：天根生化科技有限公司）、實時定量PCR引物（廠家：美國Invitrogen公司）、qPCR試劑盒（廠家：大連TaKaRa寶生物工程有限公司）。

1.4 采用儀器 采用BL-420F生物信息采集管理系統(tǒng)（成都泰盟公司制造）、QL-902渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司制造）、Centrifuge 5415D離心機(jī)（德國Eppendorf公司制造）、ABI7500熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司制造）。

1.5 檢測方法

1.5.1 血流動力學(xué)檢測方法[11]實驗4 w后，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，使用量為0.045 g/kg，之后測量右心室壓和肺動脈壓。使用BL-420F生物和功能信息收集系統(tǒng)（TME，中國成都）

1.5.2 實時定量PCR檢測[12]以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，使用Trizol試劑提取大鼠的總RNA，RNA擴(kuò)增采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、ROX plus系統(tǒng)進(jìn)行。采用95°C下30 s的最先進(jìn)行酶活化，然后包括在95°C30 sec進(jìn)行45個循環(huán)，在60°C條件下退火和延伸40 s。引物均由北京Invitrogen公司合成。上游引物：5'-GAAGATCTATGTCCCTGCTCTT CTCTCGAT-3'；下 游 引 物：5'-GGAATTCTCTGCTGGGCTGCAGGTACT-3'。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，擴(kuò)增引物為：5'-GGTGAAGGTCGGTGTCAAGG-3'，5'-CAAAGTTGTCATGCATGACC-3'，擴(kuò)增片段為496 bp。根據(jù)PCR儀自動生成的Ct值。

1.5.3 測量方法 處死實驗大鼠取出肺臟及心，預(yù)冷后生理鹽水處理，取心房組織干燥后，分別測量游離右室（right ventricle，RV）、左心室+室間隔（left ventricle+ventricular septum，LV+S）的重量，以右室/（左心室+室間隔）作為右心室肥厚指數(shù)。肺組織以10%甲醛溶液固定，之后常規(guī)石蠟包埋，染色采用彈力纖維特殊染色法，之后進(jìn)行切片。測定對象為直徑50～100μm的肺小動脈，測量其膜厚度(thickness between internal and external elastic plates,elastic plates,elastic plates,elastic plates,WT)、血管外徑（the diameter distance among external elastic plates,ED）、管腔面積（vascular lumen area，LA）、管壁面積（vascular wall area，WA）、管總面積（total vascular area，TA）。肺小動脈重塑指標(biāo)包括肺小動脈中膜厚度(WT%=2×WT/ED)、管壁面積/管總面積（WA%=WA/TA)、管腔面積/管總面積（LA%=LA/TA)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，各組間比較作方差齊性檢驗，如方差齊則進(jìn)行單因素方差分析，如方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis H檢驗），各組間比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實驗4 w后4組大鼠血流動力學(xué)變化 正常對照組大鼠平均肺動脈壓力為（17.07±4.96）mmHg，PAH組大鼠平均肺動脈壓力為（56.68±11.62）mmHg，REV組大鼠平均肺動脈壓力為（23.18±3.78）mmHg，PRE組大鼠平均肺動脈壓力為（37.25±16.51）mmHg，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。正常對照組大鼠平均右心室壓力為（8.86±3.92）mmHg，PAH組大鼠平均右心室壓力為（28.65±5.89）mmHg，REV組大鼠平均右心室壓力為（17.03±9.19）mmHg，PRE組大鼠平均右心室壓力為（22.68±9.19）mmHg，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 實驗4 w后4組大鼠肺小動脈病理形態(tài)及右心室肥厚指數(shù)改變情況 4組大鼠WT、ED、TA、LA、WT%、WA%和LA%比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 實驗4 w后4組大鼠肺小動脈病理形態(tài)及右心室肥厚指數(shù)改變情況（±s）

表1 實驗4 w后4組大鼠肺小動脈病理形態(tài)及右心室肥厚指數(shù)改變情況（±s）

?

2.3 實驗4 w后4組動物肺血管重塑病理指標(biāo)情況

PAH組大鼠的肺小動脈血管內(nèi)徑和外徑增寬，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），管壁厚度較正常對照增高；REV組和PRE組大鼠的肺小動脈血管內(nèi)徑和外徑增寬距離比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PAH組大鼠的血管內(nèi)徑和外徑增寬的距離縮短，但管壁厚度與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 實驗4 w后4組動物肺血管重塑病理圖片

2.4 實驗4 w后4組大鼠MFN2表達(dá)情況比較 正常對照組大鼠MFN2表達(dá)水平為（5.98±0.12），PAH組大鼠MFN2表達(dá)水平為（2.01±0.08），REV組大鼠MFN2表達(dá)水平為（4.12±0.09），PRE組大鼠MFN2表達(dá)水平為（4.58±0.11），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PAH組大鼠的MFN2表達(dá)水平較REV組和PRE組大鼠低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 MFN2在MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型中對平均肺動脈壓（MPAP）的影響

3 討論

本研究顯示，REV組和PRE組大鼠平均肺動脈壓力和平均右心室壓力較PAH組大鼠低，但又略高于正常對照組大鼠。原因可能是REV組和PRE組在不同時間采用了4-PBA處理，4－PBA通過抑制PERK信號通路逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)而抑制ERS。REV組和PRE組WT、ED、TA、LA、WT%、WA%和LA%高于PAH組大鼠。PAH組大鼠肺小動脈內(nèi)、外彈力板之間距離增寬，管壁較正常對照增厚，REV組和PRE組大鼠肺小動脈的內(nèi)、外彈力板之間距離與PAH組大鼠比較變短，而肺小動脈管壁厚度與正常對照組大鼠管壁厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能因ERS時線粒體接收細(xì)胞應(yīng)激，未折疊蛋白反應(yīng)時，線粒體發(fā)生去極化，線粒體膜的電化學(xué)濃度梯度改變，而MFN2可提高線粒體膜電位[13]，提示MFN2參與線粒體融合而抑制ERS，因此其可降低肺血管重構(gòu)而減少肺動脈高壓發(fā)生。

本研究顯示，PAH組大鼠的MFN2表達(dá)水平較REV組和PRE組大鼠低，且3組均低于正常對照組。這主要是因MFN2可能作為信號GTPase調(diào)節(jié)線粒體融合，其活化可保護(hù)線粒體，穩(wěn)定線粒體膜的通透性，直接參與調(diào)節(jié)線粒體的自噬[14]。同時關(guān)鍵因子MFN2、線粒體形態(tài)與細(xì)胞信號級聯(lián)通路的形態(tài)呈現(xiàn)高度整合[15]。一旦發(fā)生PAH，Ire-1、ATF-6存在在ER膜上，其可激活PERK信號通路從而使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成受到抑制，促進(jìn)發(fā)生細(xì)胞凋亡途徑，參與細(xì)胞整合應(yīng)激反應(yīng)[16]，大鼠細(xì)胞中的關(guān)鍵因子MFN2是重要的抗增殖蛋白，其最重要的作用是干擾Ras信號通路從而使質(zhì)膜生長因子受體的信號傳遞中斷[17]，因此PAH時MFN2表達(dá)降低。

綜上所述，大鼠PAH模型中MFN2表達(dá)抑制，使血流動力學(xué)增加，肺小動脈病理形態(tài)改變及右心室肥厚指數(shù)增高。但本研究僅觀察了大鼠血流動力學(xué)變化、肺小動脈病理形態(tài)、右心室肥厚指數(shù)改變、肺血管重塑和MFN2表達(dá)情況等病理生理宏觀的改變，對MFN2影響PAH的發(fā)生、發(fā)展的分子和基因方面的觀察仍不深入，另外采用大鼠PAH模型研究MFN2對PAH的影響的結(jié)果是否可應(yīng)用于人體，均需進(jìn)一步的臨床驗證。