楊麗菲，鄭樹(shù)濤，劉 清，劉 濤，張琪琪，阿爾孜古麗·吐?tīng)栠d，盧曉梅

（1省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)科一病區(qū)，3新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院，烏魯木齊830011；4新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，烏魯木齊830054）

食管癌（esophageal cancer，EC）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，根據(jù)最新發(fā)布的我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡資料顯示2015年我國(guó)食管癌的發(fā)病率和患病率分別位于第6位和第4位[1]。目前，食管癌仍是危害人群健康的主要疾病。因多數(shù)患者就診時(shí)已處于疾病中、晚期，因而五年生存率低[2]。以往的研究[3-4]表明其發(fā)病可能與遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)，但具體的病因仍不明確，因而揭示食管癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療改善患者預(yù)后尤其重要。

外泌體是由脂質(zhì)雙分子層包裹著核酸及蛋白質(zhì)的納米級(jí)膜性囊泡，細(xì)胞會(huì)根據(jù)所處環(huán)境不同分泌不同的外泌體[5]。研究發(fā)現(xiàn)多種類(lèi)型的細(xì)胞如紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等均可分泌外泌體,因此在血液、唾液、腦脊液、尿液、乳汁、腹水等多種體液中均可檢測(cè)到外泌體[5]。外泌體一個(gè)非常重要的特征就是它們攜帶了大量的核酸物質(zhì)，因而它在細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的物質(zhì)傳遞和信息交流方面發(fā)揮了極其關(guān)鍵的作用。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞分泌外泌體的量是正常細(xì)胞的十倍[6]。為進(jìn)一步明確外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性表型的影響，本研究探討食管鱗癌細(xì)胞KYSE150外泌體對(duì)其自身細(xì)胞增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 KYSE150獲贈(zèng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（Hyclone公司）、青-鏈霉素均購(gòu)自Hyclone公司。無(wú)外泌體FBS(ZETA公司)、Matrigel（BD公司）。Transwell小室（Corning公司）。外泌體提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。Exo-Glow Green綠色熒光染色試劑盒購(gòu)于SBI公司。CD9、CD81抗體購(gòu)于Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)KYSE150細(xì)胞系，培養(yǎng)基中加入含1%青－鏈霉素和10%FBS。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)消化傳代。

1.2.2 外泌體的分離與純化 KYSE150細(xì)胞在含常規(guī)10%的FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，細(xì)胞融合度約為60%～70%時(shí)，移去原有含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，使用PBS沖洗3遍，換成新鮮的含10%的無(wú)外泌體FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h左右，細(xì)胞融合度達(dá)到80%～95%左右時(shí)，收取細(xì)胞上清100 mL用于提取外泌體。依據(jù)外泌體提取試劑盒步驟，分離富集外泌體后凍于-80℃保存。

1.2.3 外泌體鑒定 電鏡鑒定：向直徑為2 mm的銅網(wǎng)上滴加20μL外泌體。室溫復(fù)染1%的醋酸鈾染液室溫約10 min,然后用濾紙吸干1%的醋酸鈾染液室溫晾干(約2 h左右)。透射電鏡于120 kV下觀察外泌體形態(tài)并拍照。外泌體粒徑分布分析：使用一定體積的PBS重懸KYSE150細(xì)胞外泌體，待外泌體稀釋至合適的濃度后，上機(jī)檢測(cè)外泌體顆粒的粒徑分布。蛋白免疫印跡鑒定：取KYSE150細(xì)胞外泌體,加入適量蛋白裂解液裂解后，4℃、12 000 rpm離心20 min,離心后上清成分即為外泌體蛋白。依據(jù)BCA試劑盒操作步驟測(cè)定外泌體蛋白濃度。上樣量為50μg進(jìn)行電泳，濃縮膠以電壓70 V電泳，進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為100 V。采用濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)膜，100 V轉(zhuǎn)膜120 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后將膜置于CD9、CD63（均為1∶1 000）的一抗4℃搖床過(guò)夜。次日TBST洗膜3次后二抗（1∶10 000）孵育1 h。后曝光液曝光顯影拍照。

1.2.4 外泌體吞噬鑒定 提前一天將KYSE150細(xì)胞接種至35 mm小皿中，每孔細(xì)胞數(shù)約2×105個(gè)，使用PKH-67綠色熒光染料按說(shuō)明書(shū)標(biāo)記外泌體和PBS。待細(xì)胞貼壁后加入熒光標(biāo)記的外泌體（20μg/mL）和同等體積PBS，培養(yǎng)2 h后，在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 提前一天將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KYSE150細(xì)胞接種至6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約1×106。待細(xì)胞貼壁后每孔用100μL槍頭劃3條平行線(xiàn)，換用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)細(xì)胞，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組加入外泌體（20μg/mL），對(duì)照組加入等量PBS。在劃痕0、24 h觀察劃痕面積并采集圖像，用Image J軟件分析細(xì)胞遷移率。

1.2.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell上室加入配置好的matrigel膠（matrigel膠：RPMI-1640培養(yǎng)基＝1∶8）60μL，37℃放置2 h。然后在transwell上室內(nèi)加入100μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，隨后將小室置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中靜置30 min以軟化基質(zhì)膜。將100μL KYSE150細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)/孔）加入上室，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組上室加150μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸的外泌體（20μg/mL），對(duì)照組小室上層加150μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組下室均加600μL含10%無(wú)外泌體FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，隨后將小室置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。第二天取出后PBS清洗兩遍，將transwell小室置于4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%結(jié)晶紫室溫染色10 min，正置顯微鏡下隨機(jī)選取約6個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均使用Graphpad 8.0軟件進(jìn)行處理分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間采用t檢驗(yàn)比較方差齊性，方差不齊時(shí)采用近似t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定 納米粒子示蹤分析顯示微粒直徑范圍多為30～200 nm；電鏡提示微粒為圓形囊狀結(jié)構(gòu)；而免疫印跡檢測(cè)提示微粒表達(dá)CD9、CD81。以上結(jié)果表明KYSE150細(xì)胞上清液中提取微粒為外泌體（圖1）。

2.2 KYSE150自身對(duì)外泌體的攝取 激光共聚焦微鏡下觀察細(xì)胞爬片，并對(duì)圖片進(jìn)行融合顯示綠色小顆粒熒光的外泌體進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)，且外泌體位于藍(lán)色大顆粒熒光的細(xì)胞核周?chē)蚝松希▓D2），提示外泌體可被KYSE150細(xì)胞吞噬。

圖1 KYSE150外泌體的鑒定

圖2 KYSE150外泌體被自身吞噬(×100)

2.3 KYSE150自身外泌體對(duì)細(xì)胞增殖的影響 外泌體實(shí)驗(yàn)組劃痕24 h細(xì)胞遷移率為(64.67±3.05)%，明顯高于PBS對(duì)照組細(xì)胞遷移率(47.67±2.52)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)，提示食管鱗癌細(xì)胞KYSE150外泌體能增強(qiáng)自身腫瘤細(xì)胞增殖，見(jiàn)圖3。

2.4 食管鱗癌KYSE150自身外泌體對(duì)細(xì)胞侵襲遷移的影響 鏡下拍照可見(jiàn)24 h時(shí)，外泌體實(shí)驗(yàn)組進(jìn)入到下室的細(xì)胞數(shù)量為(233.22±4.58)個(gè)，PBS對(duì)照組為(147.33±5.89)個(gè),外泌體實(shí)驗(yàn)組明顯高于PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，提示食管鱗癌KYSE150-外泌體能促進(jìn)自身腫瘤細(xì)胞侵襲遷移，見(jiàn)圖4。

圖3 KYSE150外泌體促進(jìn)自身增殖(×100)

圖4 KYSE150外泌體促進(jìn)自身侵襲遷移(×200)

3 討論

腫瘤已成為僅次于心血管疾病導(dǎo)致人類(lèi)死亡的第二大原因[7]。盡管包括放化療、分子靶向治療和免疫治療等在內(nèi)的抗腫瘤治療取得了重大進(jìn)展，但上述治療方案在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面仍未獲得令人滿(mǎn)意的臨床結(jié)果。目前侵襲與轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因[8]。因此，明確腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制尤其重要。

外泌體是由脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，是細(xì)胞正常生理的一部分。外泌體的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)影響受體細(xì)胞的各種生理功能。腫瘤細(xì)胞源性外泌體通過(guò)促進(jìn)腫瘤周?chē)軆?nèi)皮細(xì)胞增殖遷移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、以及促進(jìn)腫瘤增殖進(jìn)而促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[9]。因外泌體具有脂質(zhì)雙層膜，因而可以免受降解、性質(zhì)穩(wěn)定。外泌體有望成為早期診斷和個(gè)體化治療的生物標(biāo)記物。因此了解外泌體促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制意義重大。

在本研究中，成功提取出了食管鱗癌細(xì)胞KYSE150細(xì)胞外泌體，并通過(guò)電鏡、納米粒子示蹤分析、蛋白免疫印跡法成功鑒定為外泌體。本研究檢測(cè)到外泌體能被腫瘤細(xì)胞攝取和吸收，并發(fā)現(xiàn)外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移有促進(jìn)作用，進(jìn)一步證明外泌體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，將對(duì)明確食管癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移提供新的思路。

外泌體在腫瘤細(xì)胞間、腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境物質(zhì)傳遞和信息交流中發(fā)揮了非常重要的作用,它可以通過(guò)多種途徑參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程當(dāng)中。首先，外泌體是腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞溝通的橋梁，外泌體通過(guò)物質(zhì)傳遞促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自間質(zhì)細(xì)胞的外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)移血管生成相關(guān)microRNAs促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、侵襲和遷移而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。其次，腫瘤細(xì)胞源性外泌體可直接為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移開(kāi)辟道路。肝癌細(xì)胞分泌的microRNA-103能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]。再次，腫瘤源性外泌體通過(guò)物質(zhì)傳遞對(duì)遠(yuǎn)隔器官微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行改造,進(jìn)而利于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處定植而形成遠(yuǎn)轉(zhuǎn)灶。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)腦部間質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)外泌體傳遞microRNA促進(jìn)乳腺癌腦部轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤的進(jìn)展,腫瘤逐漸獲得轉(zhuǎn)移潛能,腫瘤分泌的外泌體內(nèi)容物上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變相關(guān)蛋白增加使腫瘤逐漸獲得轉(zhuǎn)移潛能,還有一些幫助原位腫瘤和微環(huán)境相互作用的蛋白也增加[13]。此外，外泌體整合素在腫瘤的器官特異性轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位定制起著重要的作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)外泌體可明顯促進(jìn)自身增殖、侵襲與遷移，與既往研究一致[15-16]。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌細(xì)胞通過(guò)外泌體傳遞miR-93-5p[17]、microRNA-21[18]等促進(jìn)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移，根據(jù)本課題組前期比較不同病變階段食管癌患者外周血外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞外泌體包含上千種蛋白質(zhì)，因此其促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制有待深入研究。