繆金露，張華建

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點實驗室，合肥 230036）

植物病害給人類尤其是發(fā)展中國家?guī)砭薮蟮慕?jīng)濟(jì)損失。近10年，全國農(nóng)作物病害總體處于高發(fā)、頻發(fā)態(tài)勢，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、國家糧食安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。在病害控制措施中，利用植物抗病性是最經(jīng)濟(jì)、最高效、最安全的防治措施。

目前，生產(chǎn)實際中植物抗病性的利用主要基于“基因?qū)蚣僬f”，即通過植物抗病基因編碼的蛋白（R）和病原菌無毒蛋白（Avr）直接或間接的互作激活抗病反應(yīng)；基于R蛋白對Avr蛋白識別而引發(fā)的免疫被稱為效應(yīng)子觸發(fā)免疫（Effector-triggered immunity, ETI）[1,2]。Avr產(chǎn)物激發(fā)的植物專化抗性依賴于植物的抗病基因；專化抗性的植株具有抗性程度高的特點，但由于田間病原菌易發(fā)生變異，導(dǎo)致這些品種的抗性不能穩(wěn)定和持久，最終易被生產(chǎn)所淘汰。

激發(fā)子可誘發(fā)植物廣譜抗性，它不是由植物單個?；涂共』蚩刂频模灰纂S著病原菌的變異而喪失，具有穩(wěn)定持久抗性的特點，在植物病害控制中具有重要的潛力[3]。這些免疫激發(fā)子非特異于某一種病原菌中，可廣泛地存在于某一類病原菌或微生物中，被稱為病原/微生物相關(guān)分子模式（Pathogen/Microbeassociated molecular patterns，PAMPs/MAMPs）[4]。除PAMPs/MAMPs外，激發(fā)子還包括植物細(xì)胞壁的成分或病原菌細(xì)胞壁被降解和修飾的組分，植物—病原物互作中產(chǎn)生的能激發(fā)植物防衛(wèi)反應(yīng)的物質(zhì)。按其化學(xué)性質(zhì)分類，主要有寡糖、糖蛋白和蛋白質(zhì)等[5]。

1985年，美國復(fù)雜碳水化合物研究中心Albersheim教授首次提出了寡糖素（Oligosaccharins），認(rèn)為一類具有生物活性的寡糖可以誘導(dǎo)植物的防衛(wèi)反應(yīng)，具有調(diào)節(jié)植物防病與抗病的功能[6]。植物細(xì)胞壁來源的寡聚半乳糖醛酸（Oligogalaeturonides）屬于酸性寡糖，被受體激酶WAK1識別，通過激酶CDPK調(diào)節(jié)乙烯（ET）的產(chǎn)生抵抗灰霉病菌Botrytis cinerea的侵染[7,8]。卵菌大雄疫霉Phytophthora megasperma f. sp.glycinea來源的葡聚寡糖（Beta-glucan）通過陰離子過氧化物酶、酚類聚合物和植保素的誘導(dǎo)積累，激發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)[9,10]。真菌稻瘟病菌Magnaporthe oryzae來源的五聚葡萄糖苷（Beta-glucan）可誘導(dǎo)水稻懸浮細(xì)胞中植保素的合成[11]。甲殼類動物（蝦、蟹）等來源的幾丁寡糖（chitin oligosaccharides，CTOS，乙酰氨基寡糖）和殼寡糖（chitosan oligosaccharides，CSOS，氨基寡糖）是目前研究最為廣泛的寡糖，可有效地誘導(dǎo)植物抗病性。CTOS和CSOS被同一受體AtCERK1識別后經(jīng)不同激酶傳遞，導(dǎo)致CTOS和CSOS信號分化[12]。以上研究結(jié)果表明，寡糖素激活不同的信號傳導(dǎo)鏈，誘發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)。

木寡糖（Xylo-oligosaccharides，簡稱XOS），是由2～7個D-木糖分子以β-1,4木糖苷鍵連接成的低聚糖，一般從玉米芯、甘蔗渣、棉籽殼、秸稈得到木聚糖后，再降解制得[13]。利用酶解法制備的木寡糖聚合度2～5，分子量低于2000 D，溶解度高，熱穩(wěn)定性強，易吸收。和其他功能性寡糖如大豆低聚糖、低聚半乳糖、果寡糖、殼寡糖等相比，木寡糖有效添加量較少、對人體的生理功能多且顯著[14]；木寡糖作為益生元可促進(jìn)雙岐桿菌增殖并增加其活性，改善人體腸道菌群結(jié)構(gòu)；抑制沙門氏桿菌、志賀氏桿菌、大腸桿菌、黃色葡萄球菌等微生物的生長繁殖，防止腹瀉；減少有害代謝物積累以保護(hù)肝臟；有效降低總血清膽固醇；促進(jìn)鈣吸收和脂代謝[15]。動物中，木寡糖可激活小鼠免疫活性[16-18]。植物中，木寡糖作為一種新的植物生長調(diào)節(jié)劑增強小白菜生長、滲透調(diào)節(jié)和產(chǎn)量；通過提高抗氧化酶活性、降低脂過氧化、增加滲透因子、保持離子平衡以促進(jìn)小白菜抗鹽脅迫[19]，而木寡糖在植物防衛(wèi)領(lǐng)域的研究則處于相對滯后的地位，對木寡糖在植物防衛(wèi)中的功能尚不明確。

本研究測定了不同濃度木寡糖對半活體病原細(xì)菌丁香假單胞菌番茄致病變種Pseudomonas syringae pv.tomato（Pst DC3000）、活體病原煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus）和死體病原真菌核盤菌Sclerotinia sclerotiorum的誘導(dǎo)抗性，以期為開發(fā)以植物來源激發(fā)子為主要成分的新型生物農(nóng)藥，設(shè)計高效、低毒的植物病害控制策略提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥Arabidopsis thaliana Columbia 生態(tài)型、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum、煙草花葉病毒侵染性克隆（TMV-GFP）、丁香假單胞桿菌番茄致病變種Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst DC3000）均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物抗病性研究室保存和提供。木寡糖來源于中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所天然產(chǎn)物和糖工程課題組。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的種植 種子經(jīng)氯氣消毒后，均勻播撒于MS培養(yǎng)基[20]，4 ℃春化3 d后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，并移栽至土中，置于溫室22 ℃、相對濕度50%、光周期16D：8L培養(yǎng)。

1.2.2 木寡糖預(yù)處理 上述條件培養(yǎng)5周大的不同擬南芥植株葉片在同一時間注射10 μL無菌水或不同濃度（25、50、100 μg/mL）的木寡糖預(yù)處理24 h后進(jìn)行病原接種試驗。

1.2.3 Pst DC3000接種 挑取活化的Pst DC3000單菌落接種于含有25 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中[21]，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心并收集菌體，用10 mmol/L MgCl2溶液重懸菌體至1×106cfu/mL，用無菌1 mL無針頭注射器將菌液從葉片背面注入，收集Pst DC3000接種2 d后植物葉片拍照記錄，試驗重復(fù)3次。

1.2.4 病毒接種 挑取TMV侵染性克隆單菌落（TMV-GFP）在含有50 mg/L卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中28 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，并用10 mmol/L MgCl2懸浮菌體至OD600=0.2，用無針頭注射器將菌體從葉背面注入，收集TMV接種7 d后植物葉片拍照并進(jìn)行定量統(tǒng)計。

1.2.5 核盤菌接種 經(jīng)PDA平板活化的核盤菌菌株1980，用0.2 cm打孔器獲得菌碟，并取5周大葉片置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行離體接種，將菌碟接種于葉片靠近主脈位置，22 ℃保濕培養(yǎng)36 h后拍照記錄發(fā)病情況。試驗重復(fù)3次。

1.2.6 病原細(xì)菌cfu值測定 取 Pst DC3000侵染的擬南芥葉片，用打孔器獲取葉盤，加入1 mL無菌水研磨獲得菌液，稀釋后涂布于含有25 mg/L利福平的固體LB平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d后計數(shù)單菌落。

1.2.7 Western blot分析 取TMV-GFP侵染的擬南芥葉片，液氮研磨至粉末，采用裂解buffer（50 mmol/L Tris-MES，10 mmol/L二硫蘇糖醇）提取蛋白。將蛋白用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上（40 V轉(zhuǎn)膜45 min），牛奶封閉后加入一抗（Anti GFP）和二抗（Goat Anti-Mouse）進(jìn)行孵育，以擬南芥Actin作為內(nèi)參；在硝酸纖維素膜上加入辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光液顯色，用Amersham Imager 600成像儀檢測蛋白表達(dá)情況。

1.2.8 熒光定量PCR（Quantitative real time-PCR，qRT-PCR） 收集核盤菌侵染的擬南芥葉片，提取基因組DNA，采用Vazyme ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒，以擬南芥Atactin和核盤菌SsTublin內(nèi)參基因在ABI 7500 RT-PCR儀上進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，定量檢測發(fā)病植物組織中的病原量。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。qRT-PCR 引物分別為：SsTublin ：5′-GTCGTCGAGCCATATAACGC-3′和 5′-GGAAACGGAGACAGGTGGTA-3′；Atactin ：5′-TCTTCTTCCGCTCTTTCTTTCC-3′和 5′-TCTTACAATTTCCCGCTCTGC-3′。采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel和Graphpad prism 7.00軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木寡糖誘發(fā)擬南芥對半活體病原細(xì)菌丁香假單胞菌番茄致病變種Pst DC3000抗性

丁香假單胞菌番茄致病變種-擬南芥是研究病原和植物互作的模式系統(tǒng)。木寡糖不同濃度預(yù)處理擬南芥，接種Pst DC3000癥狀不同（圖1）。無菌水處理的擬南芥葉片，Pst DC3000接種 2 d后出現(xiàn)典型的黃化癥狀，幾乎布滿接種的葉面；25 μg/mL木寡糖處理的植株，Pst DC3000接種的葉片出現(xiàn)黃化癥狀，但局限于小部分面積；50 μg/mL木寡糖處理的植株，Pst DC3000侵染癥狀不明顯，僅為少數(shù)肉眼可見的小黃點；100 μg/mL木寡糖處理的葉片，未見明顯病害癥狀。對不同濃度木寡糖處理的Pst DC3000侵染葉片進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)木寡糖處理的葉片細(xì)菌積累量顯著下降；與無菌水處理相比，25 μg/mL木寡糖處理顯著抑制了Pst DC3000積累。結(jié)果表明，木寡糖可誘發(fā)擬南芥對Pst DC3000抗性。

圖1 木寡糖誘導(dǎo)擬南芥對Pst DC3000抗性Fig. 1 Enhanced plant resistance to Pst DC3000 induced by XOS

2.2 木寡糖誘發(fā)擬南芥對煙草花葉病毒抗性

TMV是一種活體營養(yǎng)型病原。木寡糖不同濃度誘導(dǎo)擬南芥，接種TMV后植物葉片發(fā)病癥狀有差異。TMV侵染如無菌水處理所示，葉片接種部位沿著葉緣出現(xiàn)黃化褪綠的癥狀，7 d后可擴(kuò)展到整張葉片，系統(tǒng)葉也出現(xiàn)類似癥狀。25 μg/mL木寡糖處理的植株，接種葉和系統(tǒng)葉均出現(xiàn)黃化褪綠癥狀，但黃化程度略有降低；50 μg/mL木寡糖處理的植株，接種葉片黃化癥狀出現(xiàn)，但發(fā)病面積局限于接種點，系統(tǒng)葉肉眼可見的黃化癥狀不明顯；100 μg/mL木寡糖處理的植株，接種葉和系統(tǒng)葉均未出現(xiàn)肉眼可見的癥狀（圖2）。Western blotting顯示無菌水處理后的擬南芥植株有明顯的TMV積累，木寡糖處理的植物體內(nèi)TMV含量較無菌水處理TMV含量下降；且隨著木寡糖濃度升高，TMV積累逐漸降低。結(jié)果表明，木寡糖可誘發(fā)擬南芥對TMV抗性，且具有劑量依賴效應(yīng)，100 μg/mL木寡糖可有效誘導(dǎo)擬南芥抗TMV侵染。

圖2 木寡糖誘發(fā)擬南芥對TMV抗性Fig. 2 Enhanced plant resistance to TMV induced by XOS

2.3 木寡糖誘發(fā)擬南芥對死體病原真菌核盤菌抗性

木寡糖不同濃度對核盤菌侵染有顯著影響。與無菌水處理比較，木寡糖處理的核盤菌引起的發(fā)病癥狀和病原量下降，無菌水預(yù)處理的擬南芥葉片在病原接種部位有水漬狀病斑，25 μg/mL木寡糖處理的植株，水漬狀病斑出現(xiàn)但較無菌水誘導(dǎo)后的病斑變小，當(dāng)木寡糖增加到50和100 μg/mL時，核盤菌引起的病斑均小于25 μg/mL木寡糖處理（圖3A）。qRT-PCR顯示，濃度對木寡糖誘導(dǎo)擬南芥抗核盤菌有顯著影響，當(dāng)木寡糖為25 μg/mL時，核盤菌積累量比對照明顯降低，下降49.74%，與50和100 μg/mL木寡糖誘導(dǎo)的病原菌積累量無顯著差異，較對照降低73.96%（圖3B）。結(jié)果說明，木寡糖誘導(dǎo)擬南芥抗核盤菌侵染最低有效濃度為50 μg/mL。

圖3 木寡糖誘發(fā)擬南芥對核盤菌抗性Fig. 3 Enhanced plant resistance to S. sclerotiorum induced by XOS

3 討論

在自然條件下，病原菌嚴(yán)重威脅植物生長和發(fā)育，導(dǎo)致作物減產(chǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)半活體病原細(xì)菌 Pst DC3000、活體病原病毒TMV和死體病原真菌核盤菌是植物病原菌，均能侵染擬南芥引起明顯的病害癥狀。激發(fā)子具有誘導(dǎo)抗病活性，在病害防治中有重要潛力，其主要成分有寡糖、糖蛋白和蛋白質(zhì)等，其中細(xì)菌來源的harpin蛋白具有顯著的誘導(dǎo)植物廣譜抗性等多種生物學(xué)效應(yīng)[22]。真菌來源的幾丁寡糖能誘發(fā)植物抗細(xì)菌Pst DC3000和核盤菌病害[23]；寡糖素類激發(fā)子殼寡糖CSOS能誘發(fā)擬南芥對Pst DC3000和TMV抗性[24]，發(fā)現(xiàn)植物來源的木寡糖具有激發(fā)子活性，顯著抑制Pst DC3000、TMV和核盤菌侵染，且具有劑量效應(yīng)，說明木寡糖是一種新的寡糖素，具有對擬南芥廣譜誘導(dǎo)抗病性的活性。

在動物中，木寡糖能抑制腸道細(xì)菌沙門氏桿菌、志賀氏桿菌、大腸桿菌、黃色葡萄球菌的生長，優(yōu)化菌群結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是一種安全的寡糖素被用于保健品的研發(fā)和應(yīng)用；而木寡糖是否調(diào)節(jié)植物病原的抗性還少有報道。本研究發(fā)現(xiàn)木寡糖誘導(dǎo)擬南芥抗細(xì)菌Pst DC3000侵染，還可抑制真菌核盤菌和病毒TMV在植株體內(nèi)擴(kuò)展，表明是木寡糖一種相對安全的寡糖素可用于植物誘導(dǎo)抗性的應(yīng)用。此外，Chen等[19]發(fā)現(xiàn)木寡糖能增強小白菜（Chinese cabbage）抗氧化酶活性、降低脂過氧化、提高滲透因子、保持離子平衡以促進(jìn)小白菜抗鹽脅迫，顯示木寡糖能誘發(fā)植物抗性響應(yīng)病原和鹽等生物和非生物逆境脅迫。激發(fā)子與植物相互作用的分子機(jī)制涉及蛋白質(zhì)可逆磷酸化、活性氧迸發(fā)、蛋白激酶、離子流動和膜去極化等，推測木寡糖可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性、離子滲透等調(diào)節(jié)植物抗病性，而木寡糖誘發(fā)植物的生物和非生物逆境脅迫的相同點和特異性還有待進(jìn)一步研究。

木寡糖是一種新的植物來源能誘發(fā)植物抗病性的寡糖素。研究發(fā)現(xiàn)甲殼類動物來源的寡糖素殼寡糖能誘發(fā)擬南芥抗Pst DC3000、病毒TMV和真菌鏈格孢菌Alternaria tenuissima侵染[24-26]。殼寡糖CSOS被擬南芥受體AtCERK1識別后經(jīng)不同激酶傳遞，通過植物內(nèi)源水楊酸（salicylia acid，SA）調(diào)節(jié)對TMV抗性；依賴SA和茉莉酸（jasmonic acid JA）信號途徑調(diào)節(jié)對Pst DC3000抗性，我們發(fā)現(xiàn)植物來源的木寡糖能誘發(fā)擬南芥對Pst DC3000、TMV和核盤菌抗性，但通過怎么樣的信號途徑調(diào)節(jié)細(xì)菌、病毒和真菌的抗性還有待進(jìn)一步的解析。新的木寡糖激發(fā)子誘導(dǎo)活性的發(fā)現(xiàn)，有利于其誘發(fā)植物免疫信號傳導(dǎo)途徑的解析，探究不同寡糖素激發(fā)子信號的異同點，豐富激發(fā)子誘導(dǎo)免疫反應(yīng)分子機(jī)理，為木寡糖的應(yīng)用提供依據(jù)。