姚錦愛，黃 鵬，賴寶春，侯翔宇，余德億*

（1. 福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州350013；2. 漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，漳州363005）

草莓是福建省重要的特色經(jīng)濟(jì)作物，生產(chǎn)上草莓炭疽病發(fā)生嚴(yán)重，為草莓的主要病害之一；該病的病原菌主要為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，在草莓育苗期和移栽存活期發(fā)病最重，危害部位以短縮莖、匍匐莖和葉柄為主，造成大量爛苗、死苗，對福建草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成負(fù)面影響[1-3]。目前，該病的防治還是以使用化學(xué)農(nóng)藥為主，但易導(dǎo)致殘留和抗藥性的產(chǎn)生[4]。生物防治是植物病害防治的發(fā)展方向之一，其中利用微生物拮抗菌因環(huán)境友好、安全性高等優(yōu)點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)[5,6]。現(xiàn)階段、雖有一些貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis和解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens的菌株被用于防治草莓炭疽病菌膠孢炭疽菌[7,8]，但高效的生防資源物依舊不夠，因此仍有必要分離篩選對草莓炭疽病菌膠孢炭疽菌優(yōu)質(zhì)、高效的生防菌株。本研究以福建省漳州市草莓種植基地的土壤為拮抗菌分離來源，室內(nèi)分離測定菌株對草莓炭疽病菌膠孢炭疽菌的抑菌活性，從中篩選出抑菌率最高的菌株，在此基礎(chǔ)上對所篩菌株進(jìn)行分類鑒定及抑菌譜和盆栽防效測定，為該菌株的應(yīng)用提供支持，也為利用微生物資源防控草莓炭疽病菌膠孢炭疽菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤樣本采集自漳州市草莓種植基地，使用Z字法采樣，在草莓根系周圍10～15 cm深處采集土樣共20份。

供試的草莓炭疽病原菌Colletotrichum gloeosporioides、草莓黑斑病菌Alternaria alternata、草莓灰霉病菌Botrytis cinerea、草莓莖腐病菌Fusarium oxysporum、紅心蓮炭疽病菌Colletotrichum destructivum、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici和花生白絹病菌Sclerotium rolfsii等7株病原菌由福建省福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

供試草莓均為苗齡6個(gè)月的健康植株，采用經(jīng)121 ℃、30 min高壓蒸汽滅菌泥炭土為試驗(yàn)栽培基質(zhì)，試驗(yàn)期間常規(guī)肥水管理。

供試藥劑25 %吡唑醚菌酯懸浮劑（Pyraclostrobin，江蘇托球農(nóng)化股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌株的分離 采用稀釋涂布法分離土壤中的細(xì)菌[9]，土樣風(fēng)干后稱取1 g放入裝有9 mL無菌水的試管中混勻，依次以10倍梯度稀釋得到各濃度的土壤稀釋液。分別取10-3、10-4和10-5的稀釋液100 μL涂布于含0.1%青霉素的高氏一號（GSA）培養(yǎng)基（可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 L、pH 7.4～7.6）平板，后倒置于（28±1）℃、RH（80±5）%、光周期12L:12D的HGZ-150型光照培養(yǎng)箱（上海慧泰儀器制造有限公司）內(nèi)培養(yǎng)2 d，挑取培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化；將純化后的細(xì)菌菌株接種于NA斜面培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d，后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌株的篩選 以草莓炭疽病原菌膠孢炭疽菌為靶標(biāo)菌，采用對峙法和抑菌圈法，對分離的細(xì)菌進(jìn)行初篩和復(fù)篩[10]。初篩：用5 mm打孔器在純化好的草莓炭疽病菌邊緣打孔，將菌餅接入高氏一號平板培養(yǎng)基中心，用無菌接菌環(huán)在距菌餅25 mm的四個(gè)方向分別接入從土壤分離到的細(xì)菌，置于與1.2.1相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，從中篩選出抑菌帶寬大于5 mm的菌株進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩：將5 mm純化好的草莓炭疽病菌菌餅接入高氏一號平板培養(yǎng)基中心，置于與1.2.1相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，加入無菌水，輕輕刮下孢子，充分振蕩混勻，過濾后稀釋制成約含1×107孢子/mL懸浮液。取5 mL孢子懸浮液加入100 mL 45 ℃左右的高氏一號培養(yǎng)基中，搖勻，倒入培養(yǎng)皿中，制成含膠孢炭疽菌的平板。取初篩菌株，各自接種到裝有50 mL高氏一號液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于（28±1）℃、220 r/min的ZWY-240型旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)2 d；收集發(fā)酵種子液，于（12±1）℃、10000 r/min的KDC-140HR型高速冷凍離心機(jī)中離心20 min，后取上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌得到無菌發(fā)酵液；在含膠孢炭疽菌的高氏一號平板上用直徑5 mm的打孔器選擇合適的間距打孔，并取50 μL濾液注入小孔內(nèi)，靜置30 min后，置于與1.2.1相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測量抑菌圈直徑并記錄試驗(yàn)結(jié)果。每處理重復(fù)3次，計(jì)算每株初篩菌株的抑菌率。

1.2.3 拮抗菌株的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：先將菌株接種至高氏一號培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 24 h，初步觀察菌落形態(tài)特征；再將菌株分別接種到酵母麥芽膏瓊脂（ISP2）培養(yǎng)基（酵母膏4 g、麥芽汁10 g、葡萄糖4 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 L、pH 7）、燕麥粉瓊脂（ISP3）培養(yǎng)基（燕麥粉20 g、瓊脂18 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、MnCl2·4H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、蒸餾水1000 mL）、無機(jī)鹽淀粉瓊脂（ISP4）培養(yǎng)基（可溶性淀粉10 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 1 g、NaCl 1 g、(NH4)2SO42 g、CaCO32 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、MnCl2·7H2O 0.001 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 L）、葡萄糖天冬素瓊脂（ISP5）培養(yǎng)基（L-天門冬氨酸1 g、甘油10 g、K2HPO41 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、MnCl2·4H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 L、pH 7.2）和馬鈴薯塊等培養(yǎng)基上，觀察菌株在不同培養(yǎng)基上的孢子絲及可溶性色素顏色，對照《鏈霉菌鑒定手冊》[11]從形態(tài)特征初步鑒定拮抗菌株的屬。結(jié)合16S rDNA基因進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[12]，最終確定所篩拮搞菌株的種：用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（OMEGA）提取拮抗細(xì)菌的基因組DNA；采用16S rDNA基因通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[12]，通過C1000 Thermal Cyclers 型PCR儀（Bio-Rad）對病原菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。使用DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司，中國）回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送樣生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序；先對所測序列進(jìn)行BLAST同源性比對，后上傳登錄至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中，并從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列，在MEGA 5.0上用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并用自舉抽樣法（Bootstrapping）檢驗(yàn)可靠性。

1.2.4 拮抗菌株對其他病原菌的抑制作用 以草莓黑斑病菌A. alternata、草莓灰霉病菌B. cinerea、草莓莖腐病菌F. oxysporum，紅心蓮炭疽病菌C. destructivum、辣椒疫病菌P. capsici和花生白絹病S. rolfsii等6個(gè)屬的6種植物病原菌為靶標(biāo)菌，按照1.2.2中初篩方法活化培養(yǎng)靶標(biāo)菌和拮抗菌，用游標(biāo)卡尺測定所鑒定菌株對6種植物病原菌的抑菌帶寬，以抑菌帶寬大于5 mm為抑菌指標(biāo)。

1.2.5 拮抗菌株的盆栽防效 試驗(yàn)使用“甜查理”和“紅顏”兩個(gè)品種進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè) 3個(gè)處理：1）每株先噴施107孢子/mL草莓炭疽菌10 mL，2 d后噴施無菌水20 mL；2）每株先噴施107孢子/mL草莓炭疽病菌菌液10 mL，2 d后再噴施108孢子/mL拮抗菌ZZSP-7發(fā)酵液20 mL；3）每株先噴施107孢子/mL草莓炭疽病菌菌液10 mL，2 d后再噴施1500倍25%吡唑醚菌酯溶液20 mL。每處理30株，重復(fù)3次。接種后第14 d統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)并計(jì)算防效。病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病斑；1級，每葉病斑1～3個(gè)；2級，每葉病斑4～6個(gè)；3級，每葉病斑7～10個(gè)；4級，每葉病斑11～20個(gè)；5級，每葉病斑20個(gè)以上或病斑面積占全葉面積1/4以上[10]。病情指數(shù)＝Σ（各級病株數(shù)×各級級數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×5）×100；防治效果（%）＝（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件的DMRT檢驗(yàn)法，分析比較拮抗菌株ZZSP-7對6種植物病原菌抑菌寬度及盆栽防效的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和篩選

通過稀釋涂布法共分離到42株菌株，將分離得到的菌株與草莓炭疽病菌做生長對峙試驗(yàn)，初篩出抑菌帶寬大于5 mm的菌株5株用于復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果顯示，菌株ZZSP-7拮抗效果最好，其抑菌圈直徑為17.6 mm，對草莓炭疽病菌的生長具有抑制作用（圖 1A），最終挑選抑菌帶寬最大、抑菌效果最好的菌株ZZSP-7用于分類鑒定及抑菌譜和防效測定。

圖1 拮抗菌的抑菌圈（A）、菌落特征（B）及孢子形態(tài)（C）Fig. 1 Inhibition zone (A), colony characteristics (B) and spore morphology (C) of strain ZZSP?7

2.2 拮抗菌株的鑒定

菌株接種至高氏一號培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)初期呈淡黃色、氣絲白色；培養(yǎng)后期，氣絲逐漸由白色變灰，并產(chǎn)生灰褐色孢子層（圖2B），孢子呈圓形或橢圓形，鏈狀聚集（圖2C）。菌株在不同培養(yǎng)基上的孢子絲顏色與鏈霉菌屬Streptomyces的S. costaricanus、S. murinus、S. griseofuscus和S.graminearus等4個(gè)近緣種相似，初步將該菌株歸為鏈霉菌屬。

對菌株ZZSP-7的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增、經(jīng)測序獲得1388 bp序列片段；經(jīng)Blast比對，發(fā)現(xiàn)其16S rDNA基因序列與鏈霉菌屬的 S. murinus（NR_112445）、S. costaricanus（MT800028）、S. graminearus（GU223114）和S. griseofuscus（CP051006）相似度均高達(dá)99.93%，將16S rDNA的測序結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲得登錄號為MW356862，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取近源菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果表明菌株ZZSP-7與S. murinus、S. costaricanus、S. graminearus和S. griseofuscus聚為一支，親緣關(guān)系均相近。結(jié)合拮抗菌 ZZSP-7的形態(tài)特征，最終將菌株 ZZSP-7鑒定為鏈霉菌Streptomycessp.。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain ZZSP?7 based on the 16S rDNA sequences

表1 菌株在不同培養(yǎng)基上的孢子絲及可溶性色素與4個(gè)近緣種的比對Table 1 Colors of spore filaments and soluble pigment among strain ZZSP?7 and other four related species on different medias

2.3 拮抗菌株對其他病原菌的抑制作用

抑菌譜測定結(jié)果表明，菌株ZZSP-7對6種常見植物病原菌均具有不同程度的抑制作用，其中對葡萄孢核盤菌屬的草莓灰霉病菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬達(dá)18.3 mm，對其他5個(gè)屬的植物病原菌也有良好的抑制作用，抑菌帶寬9.3～17.1 mm（表2）。由此可見，拮抗放線菌ZZSP-7對多種病原菌具有良好的抑菌效果。

表2 菌株ZZSP?7對6種供試植物病原菌的抑菌帶寬Table 2 Inhibition width of strain ZZSP?7 against 6 phytopathogens

2.4 拮抗菌株的盆栽防效

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，接種2 d后，噴施無菌水的“甜查理”和“紅顏”品種均出現(xiàn)了葉片焦枯、倒伏，植株死亡等病狀；接種14 d后，“甜查理”品種的病情指數(shù)達(dá)31.33、“紅顏”則為54.44；而經(jīng)過拮抗菌ZZSP-7發(fā)酵液和1500倍25%吡唑醚菌酯處理的植株，“甜查理”品種病情指數(shù)分別為6.67和5.78；“紅顏”品種病情指數(shù)分別為9.33和8.67。從防治效果可以看出，菌株ZZSP-7發(fā)酵液在“甜查理”和“紅顏”上防治效果達(dá)78.64%和82.81%；該結(jié)果與1500倍25%吡唑醚菌酯防治效果81.34%和84.09%差異不顯著（表3）。說明該拮抗菌對草莓炭疽菌的發(fā)生具有抑制作用。

表3 菌株ZZSP?7對草莓炭疽病的盆栽防效Table 3 Control efficacy of strain ZZSP?7 on strawberry anthracnose

3 討論

生物防治是一種安全、有效、持久的控害方法，其中利用拮抗菌研制的生物農(nóng)藥在防治草莓炭疽菌上已有一定應(yīng)用先例[13-16]。菌株篩選和鑒定是拮抗菌開發(fā)和應(yīng)用的基礎(chǔ)；本研究從草莓種植基地土壤中分離篩選出一株對草莓炭疽病菌膠孢炭疽菌具有顯著拮抗效果的鏈霉菌ZZSP-7，其抑菌圈直徑達(dá)17.6 mm。鏈霉菌作為放線菌中的重要菌種在自然界廣泛分布，具有廣譜抗菌活性，如姚錦愛等[10]發(fā)現(xiàn)酒紅鏈霉菌S.vinaceusSVFJ-07對建蘭炭疽病菌膠孢炭疽菌具有良好的拮抗作用，李娟等[14]發(fā)現(xiàn)淡紫灰鏈霉菌S.lavendulaeDTJ-24對草莓炭疽病菌膠孢炭疽菌具有良好的抑菌作用。本研究中的鏈霉菌ZZSP-7不僅對草莓炭疽病菌有顯著的拮抗效果，對其他6種常見植物病原菌也有良好的抑制作用，抑菌譜廣，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究其在田間應(yīng)用中的效果提供了理論基礎(chǔ)。

所篩菌株僅在室內(nèi)中表現(xiàn)出拮抗作用還是不夠的，只有在應(yīng)用中依舊表現(xiàn)出良好防效的拮抗菌株，才具有生防應(yīng)用潛力。本研究中菌株ZZSP-7對草莓“甜查理”和“紅顏”品種上膠孢炭疽菌的盆栽防效達(dá)78.64%和82.81%，不僅與施用1500倍25%吡唑醚菌酯防治效果81.34%和84.09%無顯著差異，還與陳哲等[13]利用芽胞桿菌復(fù)合菌、馮江鵬等[15]利用貝萊斯芽胞桿菌JK3、李娟等[16]利用枯草芽胞桿菌TJX-012防治草莓炭疽菌的防治效果相似。說明菌株ZZSP-7對草莓炭疽病的發(fā)生具有抑制作用，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的生防潛力。拮抗菌株有效定殖是其發(fā)揮防治植物病害功效的重要條件，菌株ZZSP-7如欲投入生產(chǎn)使用，還需探討其在草莓植株體內(nèi)和栽培基質(zhì)中的定殖能力及定殖后的生防能力，也需進(jìn)一步分析其代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)，明確其抑菌機(jī)制，只有這樣才能更加安全、有效、長久地利用拮抗菌株防控目標(biāo)作物上的致病菌。