楊 迪，杜嬋娟，張 晉，潘連富，葉云峰，黃思良，付 崗*

（1. 南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，南陽 473061；2. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/廣西作物病蟲害生物學(xué)重點實驗室，南寧 530007；3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，南寧 530007）

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usarium oxysporum f. sp. cubense（Foc）侵染引起的土傳病害，是世界香蕉生產(chǎn)中面臨的最為嚴(yán)重的毀滅性病害，也嚴(yán)重制約著我國香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。由于該病為土壤傳播，常規(guī)化學(xué)藥劑很難在土壤中起到持續(xù)控病的作用；非寄主作物輪作的方式雖然可以減輕香蕉枯萎病的發(fā)生，但需要較長的輪作周期才能達(dá)到較好的防病效果；選育抗病品種理論上是控制土傳病害的最根本途徑，但由于香蕉為無性繁殖作物，抗病品種選育進(jìn)程緩慢[2-4]。隨著生物防治技術(shù)在植物土傳病害防治中的發(fā)展與應(yīng)用，利用拮抗微生物防治香蕉枯萎病將是可供選擇的一條有效防控途徑。

分離獲取具有生防潛能的微生物是開展香蕉枯萎病生物防治工作的重要基礎(chǔ)，近年來已有多種對香蕉枯萎病有拮抗作用的不同種類的生防菌陸續(xù)被報道。伯克霍爾德氏菌Burkholderia stagnalis等在平皿上對Foc表現(xiàn)出一定的拮抗作用[5]；熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens、菊歐文氏桿菌Erwinia chrysanthemi、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens、裂殼菌Schizothecium sp.等經(jīng)盆栽試驗證實對香蕉枯萎病具有較好的防效[6-11]。但受限于生防菌本身的特性和環(huán)境條件等因素，能在田間應(yīng)用的生防菌還相當(dāng)少，而關(guān)于貝萊斯芽胞桿菌防治香蕉枯萎病的報道更加鮮見。為了進(jìn)一步發(fā)掘香蕉枯萎病的生防菌資源，本研究從香蕉根際土壤中分離篩選出2株對Foc具有明顯拮抗活性的生防細(xì)菌。通過16S rRNA和gyrA基因序列及生理生化測試將其鑒定為貝萊斯芽胞桿菌，以期為香蕉枯萎病的生物防治提供新的菌種資源，也為后續(xù)抗病菌劑菌肥的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 L，pH自然。NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，水1 L，pH 7，以不加瓊脂的培養(yǎng)基為NA液體培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉10 g，水1 L，pH 7；配制LB固體培養(yǎng)基時，每升LB培養(yǎng)基加入15 g瓊脂粉[12]。

供試病原菌為Foc4號生理小種（菌株Foc1402），由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所香蕉病害研究團隊分離保存。供試香蕉苗為長勢一致的 5葉齡健康香蕉杯苗，品種為“威廉斯 B6”，購自南寧香潔農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 香蕉枯萎病拮抗細(xì)菌的分離篩選

1.2.1 土樣細(xì)菌的分離 采用五點取樣法從廣西各地蕉園采集距離地表3～10 cm處的香蕉根際土壤。稱取2 g混勻的土壤樣品加入裝有18 mL無菌水的離心管中，用渦旋振蕩器振蕩混勻，制成土壤懸浮液，用10倍梯度稀釋法依次稀釋至10-7。分別用微量移液器從稀釋倍數(shù)為10-4、10-5、10-6和10-7的土壤懸浮液中吸取100 μL涂布于NA平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，挑取形態(tài)不同的單菌落，純化后4 ℃保存，備用[13]。

1.2.2 拮抗菌的初篩 將病原菌轉(zhuǎn)接于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，用滅菌的打孔器沿菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌碟。將菌碟轉(zhuǎn)接于PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)沾取待測細(xì)菌在菌碟兩側(cè)2 cm處平行劃線，28 ℃培養(yǎng)4 d后觀察結(jié)果，選取抑菌帶寬度在3 mm以上的菌株進(jìn)行下一步篩選。

1.2.3 拮抗菌的復(fù)篩 將拮抗菌轉(zhuǎn)接于NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，制備拮抗菌發(fā)酵液，用無菌水調(diào)整菌液濃度至1×108cfu/mL，備用。將病原菌Foc1402接種于PDA試管斜面，28 ℃培養(yǎng)10 d，加入無菌水輕輕振蕩，制備Foc1402的分生孢子懸浮液，用無菌水調(diào)整孢子濃度為1×106孢子/mL，備用。

將滅菌的牛津杯放置于已加入5 mL水瓊脂的9 cm培養(yǎng)皿中央，將Foc1402的分生孢子懸浮液按1%體積比加入冷卻至45 ℃的PDA培養(yǎng)基，迅速振蕩混勻，倒入瓊脂平板上，待凝固后取出牛津杯，28 ℃培養(yǎng)6 h后，加入經(jīng)5000 r/min離心3 min的待測拮抗菌株發(fā)酵上清液，以無菌水為對照，每處理3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)3 d后測量抑菌圈直徑，計算抑菌率，選取抑菌率高的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗[14]。抑菌率（%）＝（處理抑菌圈直徑－對照抑菌圈直徑）/處理抑菌圈直徑×100。

1.3 拮抗菌株的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 將拮抗菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落形狀、透明度及菌落顏色等菌落特征，并在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.2 生理生化特征 拮抗菌株的生理生化反應(yīng)測試和結(jié)果判定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]和《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]進(jìn)行。

1.3.3 拮抗菌株的分子鑒定 將拮抗菌株接種于NA液體培養(yǎng)基，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，取1 mL細(xì)菌懸浮液15000 r/min離心1 min，收集菌體，使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司）對拮抗細(xì)菌的 DNA進(jìn)行提取。使用通用引物 27F/1492R（5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3'/ 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）和引物gyrA-F/gyrA-R（5'-CAGTCAGGAAATGCG TACGTCCTT-3'/ 5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3'），對拮抗菌的16S rRNA和DNA促旋酶A亞基蛋白（gyrA）基因序列進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系如下：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA模板 1 μL，上下游引物各 1 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min[17]。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對，并使用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 拮抗菌株的生物學(xué)特性

1.4.1 溫度對拮抗菌生長的影響 取1 mL拮抗菌株發(fā)酵液加入到100 mL NA液體培養(yǎng)基中，分別放置于10 ℃、13 ℃、16 ℃、19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃和40 ℃恒溫?fù)u床中, 120 r/min培養(yǎng)18 h，用紫外分光光度計于600 nm波長下測量吸光值，每處理3次重復(fù)[18]。

1.4.2 pH對拮抗菌生長的影響 將NA液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，取1 mL拮抗菌株發(fā)酵液分別加入到100 mL不同pH的培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min培養(yǎng)18 h，用紫外分光光度計于600 nm波長下測量吸光值，每處理3次重復(fù)。

1.5 香蕉枯萎病盆栽防治效果測定

將5葉齡香蕉苗移栽至以蛭石為基質(zhì)的直徑20 cm、高22 cm的塑料盆內(nèi)，每盆1株，室溫培養(yǎng)，每隔3 d淋水1次。移栽定植10 d后，每株蕉苗淋入40 mL濃度為1×106個孢子/mL的Foc1402分生孢子懸浮液，同時淋入100 mL濃度為1×108cfu/mL的拮抗菌發(fā)酵液，7 d后再次淋入等量相同濃度的拮抗菌發(fā)酵液1次，以無菌水為對照。所有處理均設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)6株蕉苗。接種21 d后，調(diào)查各處理發(fā)病情況，并計算各處理的病情指數(shù)和防效。依據(jù)球莖縱剖面褐變面積占總面積的百分比來確定病級：0級為球莖無褐變；1級為球莖褐變面積≤25%；3級為25%＜球莖褐變面積≤50%；5級為50%＜球莖褐變面積≤75%；7級為球莖褐變面積＞75%[19]。病情指數(shù)=∑（各級發(fā)病株數(shù)×該級代表值）/（總株數(shù)×最高級代表值）×100；防治效果（%）=（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)利用軟件DPS 9.1采用Duncan’s新復(fù)極差法分析各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離篩選

從廣西各地蕉園采集香蕉根際土壤樣品19份，分離得到細(xì)菌345株，用平板對峙法初篩得到具有拮抗作用菌株共48株，用牛津杯法測定其對Foc1402的拮抗活性，得到2株對Foc1402具有較強拮抗活性的菌株Blz67和Blz02，其中Blz67對Foc1402的抑制活性最好，抑菌圈平均直徑為34.69 mm，抑菌率為74.06%，Blz02的抑菌圈平均直徑為21.09 mm，抑菌率為57.33%（表1）。

表1 菌株Blz67與Blz02對香蕉枯萎病菌的拮抗活性Table 1 Antagonistic activities of strains Blz67 and Blz02 against Foc

2.2 拮抗菌的形態(tài)特征

菌株 Blz02和Blz67在LB固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h后，形成乳白色菌落，邊緣規(guī)則，近圓形，微凸，表面濕潤（圖1），顯微鏡下菌體形態(tài)呈桿狀。

圖1 拮抗菌Blz02（A）與Blz67（B）在LB培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of the antagonistic strains Blz02 (A) and Blz67 (B) cultured at 28 ℃ for 24 h on LB medium

2.3 拮抗菌的生理生化特征

對菌株Blz67和Blz02進(jìn)行生理生化測定，結(jié)果如表2所示，兩株拮抗菌均為革蘭氏陽性菌，硝酸鹽還原反應(yīng)和吲哚試驗結(jié)果為陽性，硫化氫、甲基紅（M.R.）和賴氨酸反應(yīng)呈陰性，可水解淀粉，能利用葡萄糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘露醇。兩株菌株的生理生化特征與RUIZ-GARCíA等[20]描述的貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis特征基本一致。

表2 拮抗菌Blz67與Blz02的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of the antagonistic strains Blz67 and Blz02

2.4 拮抗菌的分子鑒定

測序獲得菌株Blz67的16S rRNA基因片段序列長度為1400 bp（GenBank登錄號：MN961682），gyrA基因片段序列長度為937 bp（GenBank登錄號：MT380109），菌株Blz02 16S rRNA序列長度為1397 bp（GenBank登錄號：MN961683），gyrA基因片段序列長度為937 bp（GenBank登錄號：MT3395302）。BLAST結(jié)果顯示，菌株Blz67和Blz02的16S rRNA序列和gyrA序列均與貝萊斯芽胞桿菌相似性最高，可達(dá)100%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，在基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株Blz67和Blz02與貝萊斯芽胞桿菌（MT103089、MT081105、LC506620）以84%自舉值聚于同一分支（圖2A）；在基于gyrA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株 Blz67和 Blz02與貝萊斯芽胞桿菌（EU138650、CP028961、CP047157、CP046386、CP042271）以100%自舉值聚于同一分支（圖2B）。構(gòu)建的2個系統(tǒng)發(fā)育樹均表明這2株細(xì)菌與貝萊斯芽胞桿菌的親緣關(guān)系最近，結(jié)合菌株菌落形態(tài)特征及生理生化特征，將拮抗菌Blz67和Blz02鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

圖2 基于16S rRNA和gyrA基因序列構(gòu)建的拮抗菌Blz02與Blz67的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic trees based on 16S rRNA and gyrA gene sequences of the antagonistic strains Blz02 and Blz67

2.5 溫度對拮抗菌生長的影響

溫度對菌株Blz67和Blz02生長的影響極顯著，培養(yǎng)18 h后，兩株拮抗菌在低于19 ℃時，生長量較小，適宜生長溫度為22 ℃～37 ℃，菌株的生長量隨溫度上升呈先增后降趨勢；在溫度為31 ℃時，兩菌株的生長量最大，菌株Blz67和Blz02在600 nm處吸光值分別為0.7972和0.6038（圖3）。

圖3 溫度對拮抗菌Blz02和Blz67生長的影響Fig. 3 Effect of temperature on the growth of the antagonistic strains Blz02 and Blz67

2.6 pH對拮抗菌生長的影響

兩株拮抗菌菌株Blz67和Blz02最適生長pH均為5.5，在600 nm處吸光值分別為0.6132和0.6707；菌株Blz67在pH＜4.5或pH＞9.5時生長量較小，菌株Blz02在pH＜5或pH＞8.5時生長量較?。▓D4）。

圖4 pH對拮抗菌Blz02和Blz67生長的影響Fig. 4 Effect of pH on the growth of the antagonistic strains Blz02 and Blz67

2.7 對香蕉枯萎病的防治效果

蕉苗經(jīng)過接種處理后21 d，可明顯直觀地觀察到僅接種病原菌的對照組葉片發(fā)黃，而用菌株Blz67和Blz02發(fā)酵液處理的病原菌接種蕉苗葉片仍保持綠色。病情調(diào)查結(jié)果顯示，對照組蕉苗病情指數(shù)為71.43，菌株Blz67處理的蕉苗病情指數(shù)為42.86，防治效果為40.00%；菌株Blz02處理的蕉苗病情指數(shù)為26.19，防治效果為63.33%（表3）。對照組蕉苗的病情指數(shù)顯著高于試驗組，表明兩株拮抗細(xì)菌對香蕉枯萎病均有顯著的抑制作用，其中以Blz02防治效果最好。

表3 拮抗菌Blz02和Blz67對香蕉枯萎病的盆栽試驗防治效果Table 3 Control efficacies of the antagonistic strains Blz02 and Blz67 against banana Fusarium wilt under greenhouse conditions

3 討論

貝萊斯芽胞桿菌B. velezensis在自然界中廣泛存在，起初往往被認(rèn)為是解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens的同物異名種。隨后的研究發(fā)現(xiàn)gyrA基因可用于區(qū)分B. amyloliquefaciens和B. velezensis[20-23]。因此，本研究選用16S rRNA基因和gyrA基因兩段序列對兩菌株進(jìn)行分子鑒定，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及生理生化測試，將兩株拮抗菌鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

貝萊斯芽胞桿菌具有廣譜的抗菌活性和促生作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景[24,25]。目前已有利用貝萊斯芽胞桿菌防治草莓炭疽病、馬鈴薯疥瘡病、黃瓜枯萎病、小麥白粉病、小麥赤霉病、番茄青枯病、水稻稻瘟病等多種植物病害的報道[26-32]。然而關(guān)于利用貝萊斯芽胞桿菌防治香蕉枯萎病鮮有報道，本研究進(jìn)一步擴展了貝萊斯芽胞桿菌抗病譜，也為香蕉枯萎病的生物防治提供了新的菌種資源。

生物學(xué)特性測試結(jié)果表明，兩株貝萊斯芽胞桿菌適宜生長的溫度范圍較廣（22 ℃～37 ℃），最適生長pH為5.5，為弱酸性。由于Foc也是在偏酸性土壤環(huán)境中更易生長和產(chǎn)孢[33]，本研究獲得的兩株拮抗菌在未來田間防治香蕉枯萎病的應(yīng)用中將可能具有較好的防病潛力。

本研究中兩株拮抗菌平板測試的抑菌活性強弱與盆栽防效高低不一致，菌株Blz67在平板上對Foc1402的抑菌率較高（74.06%），但在盆栽試驗中，卻是菌株Blz02的防效較高（63.33%），菌株Blz67的防效為40%。該結(jié)果暗示兩株拮抗菌可能存在不同的防病機制。在平板篩選試驗中，發(fā)揮作用的主要是菌株產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的活性與能力，而在盆栽試驗中，防病效果不僅與菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)相關(guān)，還有可能與菌株的定殖能力、生態(tài)競爭力及誘導(dǎo)蕉苗抗性能力相關(guān)[4]。本研究篩選出兩株生防菌株的具體防病作用機制還有待進(jìn)一步探究。