茍浩鋮，范麗，李麗，李金澤，馮俊

(1.川北醫(yī)學(xué)院 川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 南充市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 南充市中心醫(yī)院 泌尿外科，四川 南充 637000)

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌5年生存率約為40%～60%，全球每年發(fā)病約為 60 萬(wàn)人[1-2]。下咽鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱(chēng)下咽鱗癌)是常見(jiàn)的頭頸部癌癥，晚期預(yù)后較差[3]。目前的治療采用以手術(shù)、放/化療為主，輔以分子靶向治療及免疫治療的綜合治療[4]，晚期下咽癌手術(shù)治療及保喉治療的5年生存率無(wú)明顯差異，均為38%～58%，有待提高[5]。細(xì)胞焦亡是一種由炎性小體通過(guò)gasdermins誘導(dǎo)的不同于細(xì)胞凋亡的程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞焦亡與動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病及肝炎后的肝癌有明顯的相關(guān)性[6-7]。細(xì)胞焦亡在不同腫瘤中扮演著不同的角色。在不同類(lèi)型的腫瘤中，細(xì)胞焦亡被激活的機(jī)制不同，且其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用也不同，在與結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌中對(duì)腫瘤有抑制作用，但也能促進(jìn)皮膚癌、乳腺癌的進(jìn)展[8-9]。但是細(xì)胞焦亡是否參與下咽癌的發(fā)生發(fā)展尚未可知，本文應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞焦亡相關(guān)因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Capase1)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)在下咽鱗癌中的表達(dá)，并對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 患者資料及標(biāo)本

收集川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院及川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2015年1月—2019年12月病理確診為下咽鱗癌，并于本院進(jìn)行手術(shù)治療、且在病理科有完整的可用的石蠟標(biāo)本患者共11例(其中2例無(wú)切緣)。11例患者均為男性，年齡43～70歲，平均年齡61歲，臨床根據(jù)第八版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)下咽癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，T分期：T1期1例，T2期3例，T3期6例，T4期1例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例；臨床分期：III期6例，IV期5例；高分化4例，中分化5例，低分化2例。將所有標(biāo)本水平連續(xù)切成4 mm厚的石蠟切片，用于免疫組化染色。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 試劑來(lái)源

Caspase1兔單克隆抗體購(gòu)自Invitrogen公司。IL-1β兔多克隆抗體、IL-18兔多克隆抗體及山羊抗兔二抗均購(gòu)自abcom公司。二甲苯、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)。

1.3 方法

采用免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片烤片后脫蠟水化，用高壓修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，過(guò)氧化物酶阻斷劑滅活過(guò)氧化物酶活性，滴加正常羊血清封閉液，滴加一抗后于4℃過(guò)夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃搖床孵育1 h，DAB法顯色3～8 min，在顯微鏡下掌握染色程度，蘇木素復(fù)染5 min。用已知陽(yáng)性組織切片作陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)作陰性對(duì)照。請(qǐng)兩位病理科副主任醫(yī)師依據(jù)許良忠教授提出的免疫組化結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)[10]，結(jié)合3種抗體著色強(qiáng)度及著色細(xì)胞數(shù)量對(duì)3種抗體的表達(dá)進(jìn)行評(píng)定，評(píng)定結(jié)果有分歧者請(qǐng)第3位病理科副主任醫(yī)師進(jìn)行評(píng)定，取三者中相近的結(jié)果作為最終結(jié)果。評(píng)定結(jié)果分為陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、中陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 22.0 進(jìn)行處理，通過(guò)秩和檢驗(yàn)比較3種抗體在腫瘤組織及癌旁組織的表達(dá)。采用Spearman秩相關(guān)分析下咽鱗癌癌組織中Capase1與IL-1β、IL-18表達(dá)的相關(guān)性，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下咽鱗癌組織與癌旁組織中3種抗體的表達(dá)

11例下咽鱗癌組織及9例癌旁組織中3種抗體的表達(dá)見(jiàn)表1、圖1～3，腫瘤組織中3種抗體表達(dá)高于癌旁組織，通過(guò)秩和檢驗(yàn)分析，3種抗體在腫瘤組織及癌旁組織的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 下咽鱗癌組織中3種抗體表達(dá)的相關(guān)性分析

采用Spearman秩相關(guān)分析方法分析Capase1與IL-1β、IL-18表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明Capase1與IL-1β、IL-18表達(dá)的相關(guān)系數(shù)均大于0.6，呈顯著正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表1 下咽鱗癌組織與癌旁組織中3種抗體的表達(dá) [例(%)]

表2 腫瘤組織中3種抗體陽(yáng)性率相關(guān)性分析 [例(%)]

3 討論

細(xì)胞焦亡是由多種病原體或非感染因素刺激而導(dǎo)致的一種固有免疫反應(yīng)，是細(xì)胞發(fā)生的一種依賴(lài)半胱天冬氨酸蛋白酶Caspase、炎癥小體介導(dǎo)的一種程序性死亡[11]，它通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)復(fù)制龕和增強(qiáng)宿主的防御反應(yīng)在清除各種細(xì)菌和病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，細(xì)胞焦亡失調(diào)可能導(dǎo)致病原體清除效率降低，刺激適應(yīng)性免疫防御功能紊亂，導(dǎo)致組織損傷[8]。故細(xì)胞焦亡可作為機(jī)體炎癥壞死及免疫反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制之一參與炎性疾病及炎癥相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

焦亡細(xì)胞的特征是細(xì)胞膜孔隙形成、胞質(zhì)膨脹、膜破裂，并將IL-1β等胞質(zhì)內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，放大局部或全身炎癥效應(yīng)[12-13]。研究者為證實(shí)細(xì)胞焦亡是否參與下咽鱗癌的發(fā)生發(fā)展，對(duì)下咽鱗癌及癌旁組織的細(xì)胞焦亡相關(guān)因子Capase1、IL-1β、IL-18進(jìn)行免疫組化染色，并對(duì)其表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明Capase1、IL-1β、IL-18在腫瘤組織的表達(dá)高于癌旁組織，且在腫瘤組織中Capase1的表達(dá)與IL-1β、IL-18的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合細(xì)胞焦亡激活機(jī)制，在細(xì)胞膜上形成孔洞，細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，引起細(xì)胞膜滲透性紊亂以及炎癥因子IL-1β和IL-18 的釋放，最終造成細(xì)胞裂解死亡[14-15]。這表明，細(xì)胞焦亡參與了下咽鱗癌的生物學(xué)進(jìn)程。

IL-1β和IL-18與IL-1結(jié)構(gòu)相似，是IL-1細(xì)胞因子家族中的一員，IL-1通過(guò)調(diào)節(jié)一些與腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的相關(guān)基因參與腫瘤進(jìn)展[16-17]。IL-1β在腫瘤微環(huán)境中主要由腫瘤浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，并通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；包括通過(guò)增加IL-1靶點(diǎn)的表達(dá)促進(jìn)血管生成，以及增加可在腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中引發(fā)抗凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的可溶性介質(zhì)的表達(dá)等[18]。有研究表明，IL-1β刺激可增加肌成束蛋白表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致口腔鱗狀細(xì)胞癌侵襲性增加[17]。就像炎癥對(duì)于腫瘤細(xì)胞的作用具有兩面性一樣，IL-18對(duì)腫瘤細(xì)胞而言也是一把雙刃劍。IL-18在免疫應(yīng)答中的作用，主要是由干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的產(chǎn)生介導(dǎo)的，提示IL-18具有抗腫瘤作用，在動(dòng)物癌癥模型中，給予IL-18后腫瘤消退表明該細(xì)胞因子具有抗腫瘤特性；另一方面，IL-18在某些癌癥患者的血清中高表達(dá)似乎是其癌前效應(yīng)的線索，這種細(xì)胞因子通過(guò)抑制CD70來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞逃離免疫系統(tǒng)，此外，IL-18可通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和CD44促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移[19]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，細(xì)胞焦亡釋放的IL-1β和IL-18參與了下咽鱗癌的生物學(xué)進(jìn)程，其在癌組織的高表達(dá)，至少可以說(shuō)明在下咽鱗癌的某一進(jìn)程中，炎癥因子對(duì)下咽鱗癌的進(jìn)展有促進(jìn)作用。

細(xì)胞焦亡參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在不同的腫瘤及同一腫瘤的不同進(jìn)程中，細(xì)胞焦亡都可能扮演著不同的角色。Wei等[20]研究表明，E2誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化觸發(fā)細(xì)胞焦亡，抑制肝癌細(xì)胞自噬；Yue等[21]研究表明花青素通過(guò)活化焦亡作用促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的死亡，抑制腫瘤的進(jìn)展，在另一方面，Guo等[22]的研究表明炎癥因子IL-1β在促進(jìn)乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。但目前為止，細(xì)胞焦亡及細(xì)胞焦亡所釋放的炎癥因子在下咽鱗癌中的作用尚不清楚，其分子機(jī)制也有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

當(dāng)然，鑒于本研究樣本量有限，可能增大實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差，部分結(jié)果尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并反復(fù)驗(yàn)證以保證結(jié)果的有效參考意義。進(jìn)一步深入的分子機(jī)制研究至關(guān)重要。探索是否可以通過(guò)某些藥物作用于細(xì)胞焦亡相關(guān)分子靶標(biāo)對(duì)細(xì)胞焦亡進(jìn)行調(diào)控，以達(dá)到幫助治療下咽鱗癌或判斷其預(yù)后的臨床目的。