賈巧靜，賈曉芳，張海中，岳麗艷，張玉波，單春光

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 耳鼻咽喉一科，河北 石家莊 050000)

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，以原發(fā)性較為多見，鱗狀細胞癌最多，大約占耳鼻咽喉部位惡性腫瘤的7.9%～35%[1]，在頭頸部惡性腫瘤中排名第3位。迄今為止，喉癌的治療方式一直采用手術切除原發(fā)區(qū)癌組織及淋巴結，配合放療化療及細胞抑制劑。在某些情況下，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR) 靶向抗體西妥昔單抗和程序性死亡受體-1 (programmed death receptor-1，PD-1)抗體也用于喉癌的臨床治療。因其具有易復發(fā)、轉移快以及預后差的特點，對患者的生理、心理及正常生活帶來許多痛苦。對喉癌采取治療及干預措施后，其晚期患者的5年生存率仍不盡人意[2-3]。因此，尋找新的特異性靶點對于喉癌的治療具有重要意義。

在腫瘤微環(huán)境中，惡性腫瘤細胞通過葡萄糖攝入進行高效的糖酵解，并將乳酸轉運出細胞作為糖酵解過程的中間產(chǎn)物。在過去，乳酸常常被認為是代謝垃圾，然而有研究表明乳酸可作為信號傳導分子，激活特定的G蛋白偶聯(lián)受體81(G protein-coupled receptor, GPR81)。GPR81的表達特征與能量代謝異常密切相關。目前有報道稱其在各種原發(fā)性腫瘤細胞中均具有高表達特性[4-6]，并參與惡性腫瘤的增殖、分化、生長、生存及細胞凋亡[7-9]。單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporters, MCT)在維持糖酵解進程中扮演重要角色，并具有乳酸調控及pH值控制的雙重功能[10-11]。Na+-葡萄糖共轉運蛋白(sodium-glucose co-transporter 1，SGLT-1)是一種高親和力、低容量的受體，可運輸兩個鈉分子和一個葡萄糖分子，介導小腸細胞對葡萄糖的攝取和近端腎小管的S3段，主要作用是介導跨膜吸收葡萄糖和半乳糖[12-13]。本研究主要通過構建GPR81-shRNA，并轉染至Hep2細胞中，聯(lián)合順鉑誘導后，研究其與MCT4、SGLT-1表達的相關性，以及通過檢測細胞凋亡抑制蛋白(survivin)的表達，研究其對細胞凋亡的影響，進而闡述GPR81與順鉑誘導在喉癌發(fā)生機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

使用的一抗GPR81購自Santa Cruze，SGLT-1、MCT4、survivin一抗購自Abcam，一抗beta-actin及二抗購自三鷹，抗體為兔抗人。細胞培養(yǎng)基RPM1640購買于索萊寶，胎牛血清購買于依科賽生物科技公司(中國)，雙抗、蛋白裂解液RIPA和BCA蛋白濃度提取試劑盒購自索萊寶。轉染試劑Lip3000購自Invitrogen。RNA提取試劑Trizol及cDNA反轉錄試劑盒購自北京天根。胰酶、青霉素、鏈霉素購自于索萊寶。

1.2 細胞培養(yǎng)與刺激

喉癌Hep2細胞系為我院耳鼻咽喉科實驗室保存。Hep2細胞培養(yǎng)于T25細胞培養(yǎng)瓶，包含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPM1640細胞培養(yǎng)基5 mL。培養(yǎng)條件為37℃，培養(yǎng)箱保持5%CO2、濕度95%。待細胞貼壁生長數(shù)量達5×106，對Hep2細胞傳代培養(yǎng)至6孔板，待細胞濃度為(1.0～2.0)×105個/孔時進行shRNA轉染。帶有綠色熒光蛋白(GFP)標簽的shRNA-GPR81質粒和shRNA-scramble(對照)質粒由廣州賽業(yè)生物公司合成。采用Lip3000進行質粒轉染，轉染過程參照說明書。轉染48 h后熒光顯微鏡下通過GFP表達情況觀察細胞轉染程度，對于轉染達75%以上的細胞用不同濃度順鉑誘導處理。順鉑濃度分別為0、0.5 、1、2、5 μg/mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集蛋白。每組設置3個重復。另外，未經(jīng)質粒轉染的Hep2細胞經(jīng)5 μg/mL順鉑刺激后，分別于培養(yǎng)箱中誘導0、12、24、48 h后收集樣品用于RNA提取或蛋白分離，每個刺激設置3個重復。用于RNA提取的Hep2細胞經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗后加入500 μL Trizol，用于后續(xù)RNA提取。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA提取及cDNA第一條鏈的合成 將轉染了shRNA-GPR81質粒(實驗組)和shRNA-scramble質粒(對照組)的Hep2細胞用預冷無菌PBS置于搖床清洗3次，每次5 min，棄去PBS后，每孔加入500 μL Trizol，冰上裂解，將裂解液吸出至2 mL無RNA酶離心管中，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩30 s，冰上靜置10 min。然后輕輕吸出上清液，加入500 μL異丙醇，上下顛倒混勻，冰上靜置15 min，之后4℃，12 000 g離心15 min，吸出上清后，加入1 mL 75%乙醇，上下顛倒混勻，之后4℃，12 000 g離心5 min，將上清吸出，置于空氣中干燥30 min，最后根據(jù)RNA的豐度高低加入30～100 μL DEPC水。使用NanoDrop 2000C檢測RNA濃度。cDNA第一條鏈的合成參照FastQuant cDNA 第一條鏈合成試劑盒說明書。

1.3.2 半定量聚合酶鏈式反應(PCR) 以上述反轉錄的Hep2細胞cDNA為模板，beta-actin為內參基因，利用半定量PCR分析GPR81基因在GPR81基因沉默的Hep2細胞中mRNA水平變化，進而檢測GPR81-shRNA的干擾效率。引物采用Primer 5設計，引物序列如表1。半定量PCR反應體系為：超純水8 μL，PCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，不同刺激處理的cDNA模板1 μL。半定量PCR反應程序為：95℃預變性5 min，95℃變性45 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，72℃再延伸10 min。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用Image J進行灰度值分析。

表1 引物序列信息

1.3.3 蛋白印跡分析(Western Blot) 用于蛋白分離的Hep2細胞經(jīng)無菌PBS清洗后，加入放射免疫沉淀實驗(RIPA)裂解液冰上裂解30 min，然后用細胞刮刀刮取細胞，4℃，12 000 g離心15 min后，吸取上清，用二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，99℃加熱10 min使得蛋白質變性，然后冰上放置2 min，可凍存于-80℃用于Western Blot。經(jīng)變性的蛋白裂解液用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠進行蛋白分離，再將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用含有5%牛血清白蛋白的加入吐溫20的Tris-鹽酸緩沖液(TBST)在37℃恒溫箱中封閉1 h。TBST與一抗按照1∶500比例進行稀釋，用封口膜將轉有蛋白的PVDF膜密封浸潤在一抗中，于4℃搖床孵育過夜。將孵育后的PVDF膜置于搖床上用TBST室溫清洗3次，每次5 min，然后加入辣根過氧化酶標記的二抗(TBST與二抗按照1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，經(jīng)TBST清洗2～3次后，加入化學發(fā)光顯色劑進行顯色，然后采用化學發(fā)光儀對蛋白進行發(fā)光。采用Image J進行灰度值分析目的蛋白的表達情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用統(tǒng)計軟件SPSS 20對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA，Duncan)和獨立樣本t檢驗，取α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)分析完成后，導入excel表格中，使用Origin 7作圖。

2 結果

2.1 GPR81基因沉默聯(lián)合順鉑誘導對MCT4、survivin及SGLT-1表達的影響

采用半定量PCR方法和Western Blot檢測GPR81在Hep2細胞中的基因沉默效果，如圖1所示。GPR81在GPR81基因沉默的Hep2細胞中其mRNA水平和蛋白質水平的表達量分別為shRNA-scramble組的0.28倍(P<0.01)和0.31倍(P<0.05)。

GPR81基因沉默的喉癌Hep2細胞經(jīng)0、0.5、1、2、5 μg/mL順鉑誘導24 h后MCT4、SGLT-1及survivin的表達情況如圖2～4所示。MCT4在轉染了shRNA-GPR81的Hep2細胞和轉染shRNA-scramble的Hep2細胞中其表達均呈現(xiàn)下調趨勢。其中，在shRNA-GPR81組中，在順鉑濃度2 μg/mL及5 μg/mL刺激中，其表達與0 μg/mL的順鉑誘導下的表達比較有顯著下調趨勢，分別為0 μg/mL順鉑刺激組的0.29倍和0.2倍(P<0.05)。MCT4在對照組中的表達趨勢亦呈現(xiàn)下調趨勢，在2 μg/mL及5 μg/mL順鉑刺激下，與無順鉑誘導下的表達比較有顯著差異，分別為無順鉑誘導條件下MCT4表達量的0.35倍及0.28倍(P<0.05)，其中在1μg/mL順鉑誘導的shRNA-GPR81細胞中MCT4的表達顯著低于shRNA-scramble細胞中MCT4的表達，約為shRNA-scramble組的0.65倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖4所示。

圖1 GPR81在轉染不同質粒的Hep2細胞中的mRNA及蛋白水平表達結果 A、B：GPR81在轉染不同質粒的Hep2細胞中的mRNA水平的表達及統(tǒng)計結果；C、D：GPR81在轉染不同質粒的Hep2細胞中的蛋白水平的表達及統(tǒng)計結果 (1：轉染shRNA-scramble質粒；2：轉染shRNA-GPR81質粒)

SGLT-1在轉染shRNA-GPR81的Hep2細胞中其表達趨勢呈現(xiàn)先上調，在2μg/mL順鉑誘導下，其表達達到最高峰，為無順鉑刺激組表達量的3.38倍(P<0.01)，其后表達降低，為無順鉑刺激組表達量的2.7倍 (P<0.05)。而在shRNA-scramble對照組中，SGLT-1在不同濃度順鉑誘導下其表達呈現(xiàn)總體下降的趨勢，其中在5μg/mL順鉑誘導下，表達量最低，為無順鉑誘導條件下的0.49倍(P<0.05)。其中SGLT-1在0.5、1、2、5μg/mL的順鉑誘導的GPR81基因沉默的Hep-2細胞中的表達均顯著高于陽性對照組Hep-2細胞。其中在2μg/mL順鉑誘導時其差異最顯著，約為shRNA-scramble組的4.5倍(P<0.05)，如圖3所示。

Survivin在轉染了shRNA-GPR81的Hep2細胞中其表達呈現(xiàn)下降趨勢，其中在0.5、1、2、5 μg/mL順鉑誘導條件下與無順鉑誘導相比，分別為無順鉑誘導下survivin表達量的0.74、0.61、0.44、0.36倍，在5 μg/mL順鉑誘導條件下達到最低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，該結果表明survivin對GPR81沉默及順鉑誘導比較敏感。同時，在順鉑誘導的shRNA-scramble對照組Hep2細胞中，survivin的表達也呈現(xiàn)下調趨勢，其中在0.5、1、2、5 μg/mL順鉑誘導條件下與無順鉑誘導相比，分別為無順鉑誘導下survivin表達量的0.92、0.84、0.71、0.56倍。在5μg/mL的順鉑誘導條件下，達到最低值，為無順鉑誘導條件下表達量的0.56倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但該組survivin表達的抑制程度比shRNA-GPR81組弱，兩組在2 μg/mL及5 μg/mL順鉑誘導下表達量前者約為后者的0.62倍和0.64倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖5所示,這一結果說明GPR81基因沉默聯(lián)合順鉑誘導可抑制survivin的表達，進而促進細胞凋亡的發(fā)生。

圖2 GPR81基因沉默聯(lián)合順鉑誘導條件下Hep2細胞中MCT4的表達情況 A:在轉染了shRNA-scramble和轉染了shRNA-GPR81質粒的Hep2細胞經(jīng)不同濃度順鉑誘導后MCT4表達情況；B：MCT4蛋白表達的統(tǒng)計學分析;DDP為順鉑，下圖同

圖3 GPR81基因沉默聯(lián)合順鉑誘導條件下Hep2細胞中SGLT-1的表達情況 A:在轉染了shRNA-scramble和轉染了shRNA-GPR81質粒的Hep2細胞經(jīng)不同濃度順鉑誘導后SGLT-1表達情況；B：SGLT-1蛋白表達的統(tǒng)計學分析

圖4 GPR81基因沉默聯(lián)合順鉑誘導條件下Hep2細胞中survivin的表達情況 A:在轉染shRNA-scramble和轉染了shRNA-GPR81質粒的Hep2細胞經(jīng)不同濃度順鉑誘導后survivin表達情況；B：survivin蛋白表達的統(tǒng)計學分析

2.2 順鉑誘導MCT4、survivin及SGLT-1在喉癌Hep2中的表達特征

Hep2細胞經(jīng)5 μg/mL順鉑誘導0、12、24、48 h后，MCT4、survivin及SGLT-1在喉癌細胞中的表達情況如圖5所示。MCT4在順鉑誘導下，隨著時間的推移，其表達呈現(xiàn)下調趨勢，其中24 h的表達量與48 h的表達量分別為0 h表達量的0.44倍和0.34倍，與0 h表達量相比顯著下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Survivin基因在順鉑誘導下隨著誘導時間的變化，其表達趨勢逐漸下降。在48 h下降到最低值，約為0 h刺激表達量的0.281倍，二者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SGLT-1在順鉑誘導下的表達情況也是被抑制表達的，隨著誘導時間的延長，其表達逐漸下調，在48 h達到最低值，約為0 h的0.29倍(P<0.05)。

3 討論

腫瘤是一種動態(tài)的假器官，其包含多種類型的細胞，并通過細胞間的相互作用產(chǎn)生一種獨特的生理微環(huán)境。在腫瘤細胞網(wǎng)絡中，惡性腫瘤細胞會遭遇很多挑戰(zhàn)，如物理壓力、氧化應激、營養(yǎng)匱乏、細胞間競爭、乏氧及免疫監(jiān)視與放化療抵抗等，并通過改變能量代謝特性來適應各種挑戰(zhàn)。

MCT4在細胞中主要參與一元羧酸等胞內的釋放過程，其對丙酮酸親和力較低，對乳酸的親和力較高，并受分解代謝的核轉錄因子如缺氧誘導因子HIF-1a及核轉錄因子NF-kB調控，在腫瘤相關的成纖維細胞中具有高表達特征[13]，有報道稱在多種惡性腫瘤中MCT1和MCT4表達上調，可以作為腫瘤治療的潛在靶向分子[14]。目前尚無明確的研究報道順鉑誘導及GPR81對MCT4表達的影響。在本研究中經(jīng)順鉑誘導后MCT4的表達隨著時間推移其表達量逐漸降低，并在48 h達到最低，說明Hep2細胞經(jīng)順鉑誘導后其乳酸含量減少。我們在先前的預實驗中發(fā)現(xiàn)，糖酵解反應過程中的第二個限速酶磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase-1，PFK-1)經(jīng)相同條件的順鉑誘導后其表達也呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，因此推測順鉑對糖酵解可能存在一定的抑制作用，進而說明糖酵解過程的葡萄糖攝入及乳酸累積降低。這一結論也能從側面解釋MCT4經(jīng)順鉑誘導后表達下調的原因。MCT1、MCT4及GPR81是乳酸轉運的重要參與者，三者共同調控乳酸的來源與去向，維持細胞能量代謝的正常進行。在本研究中，GPR81基因沉默的Hep2細胞聯(lián)合不同濃度順鉑誘導后與對照組相比，MCT4仍表現(xiàn)為下調趨勢，根據(jù)這一結果我們推測GPR81的缺失聯(lián)合順鉑誘導對乳酸的轉運具有抑制作用。

圖5 順鉑誘導不同時間的MCT4、survivin、SGLT-1表達情況 A: Hep2細胞經(jīng)順鉑誘導0、12、24、48h后，MCT4、survivin及SGLT-1在蛋白水平的表達情況；B: 統(tǒng)計分析結果

GPR81作為糖酵解反應中間產(chǎn)物乳酸的受體，其表達量的高低與能量代謝過程密切相關。SGLT-1在腫瘤中具有高表達特性，通過介導葡萄糖的轉運為腫瘤細胞提供營養(yǎng)，促進腫瘤細胞的生長[15]。葡萄糖作為細胞的主要能量來源，可通過SGLT-1轉運葡萄糖，以滿足腫瘤細胞通過高效的糖酵解反應獲取細胞增殖所需的能量。目前已有許多研究表明SGLT-1可在多種腫瘤細胞中表達，如肺癌、頭頸腫瘤、宮頸癌等[16-18]。有研究報道，順鉑可以降低SGLT家族的親和力(主要是SGLT-2)，抑制其在近曲腎小管上皮細胞中的表達[19]。該機制可能是通過共價鉑與轉運蛋白的巰基(SH)集團藕聯(lián)來實現(xiàn)的[20]?？紤]到SGLT-1與SGLT-2氨基酸序列具有59%的同源性[21]，我們推測SGLT-1在順鉑誘導下也能發(fā)揮其相應的功能。本研究中SGLT-1經(jīng)順鉑誘導不同時間后，其表達呈現(xiàn)下調趨勢，說明順鉑可抑制SGLT-1的表達，相似的研究結果在腎小管上皮細胞的相關報道中也出現(xiàn)過[22]。我們知道，糖酵解反應的中間產(chǎn)物乳酸可以作為GPR81的配體激活GPR81，進而下調cAMP及減弱蛋白激酶A(PKA)調控的信號轉導通路。而有研究表明SGLT-1在糖酵解能量代謝過程中，為葡萄糖的攝入、能量儲存及轉運發(fā)揮重要作用[23-24]，進而影響乳酸的合成。因此，我們推測GPR81的表達量高低在一定程度上會影響SGLT-1的表達，進而影響生物體能量代謝的過程。本研究中在GPR81基因沉默的Hep2細胞中，經(jīng)順鉑誘導后SGLT-1蛋白表達整體呈現(xiàn)先上調趨勢，在2μg/mL的順鉑濃度誘導后達到最大值，經(jīng)5μg/mL順鉑誘導后其表達又呈現(xiàn)下調趨勢，但整體與陽性對照組相比表達上調。這一結果提示我們，在順鉑誘導的情況下，GPR81基因沉默會增加SGLT-1的表達，進而促進葡萄糖的轉運，為機體活動提供能量供應。從某種角度來說，SGLT-1表達的升高是細胞應對順鉑誘導而獲得的一種自我保護功能。

眾所周知，順鉑誘導可導致細胞凋亡的發(fā)生。有研究表明，在腫瘤體內實驗及體外實驗經(jīng)順鉑誘導后，均可導致凋亡抑制蛋白表達量的下調[25-26]。GPR81在乳腺癌患者的腫瘤組織及乳腺癌的幾種細胞系中具有高表達，GPR81基因敲除后可導致乳腺癌細胞生長受損，并導致細胞凋亡的發(fā)生[9]。本研究中，順鉑誘導Hep2細胞后survivin的表達隨著時間呈現(xiàn)下調趨勢，GPR81基因敲除聯(lián)合順鉑誘導后的Hep2細胞中，survivin在不同濃度順鉑誘導下，也呈現(xiàn)下調趨勢，即細胞凋亡啟動。這一研究結果與當前的研究結果一致，說明GPR81基因沉默對于細胞凋亡具有促進作用。

綜上所述，GPR81基因沉默聯(lián)合順鉑誘導對喉癌細胞能量代謝相關的MCT4、SGLT-1的表達具有不同程度的影響，而且對細胞凋亡的發(fā)生也具有促進作用，這一研究結果可為臨床治療化療抗性的喉癌提供一定的理論指導，為今后研究靶向治療喉癌奠定基礎。