卞龍艷 莊敏 李姝 戴穎

白內(nèi)障是以晶狀體上皮細(xì)胞損傷引起晶狀體混濁為主要特征的眼科疾病[1]，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是其發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)。Bai等[2]研究證實，活性氧簇(ROS)大量蓄積引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生。最近有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(myocardial infarction-associated transcript，MIAT)可能是白內(nèi)障疾病中一個很有前途的功能性長鏈非編碼RNA(lncRNA)[3]，可以作為內(nèi)源競爭性RNA與各種編碼蛋白質(zhì)的信使RNA競爭性結(jié)合或共享微小RNA(miRNA)，從而抑制 miRNA對靶基因的調(diào)控[4]。目前關(guān)于lncRNA-MIAT在白內(nèi)障中的作用和調(diào)控作用尚未明確。因此，本研究通過過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，探討lncRNA-MIAT對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的調(diào)控作用及其機(jī)制，以期為白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制研究及臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料人晶狀體上皮細(xì)胞株 HLE-B3購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)。DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞檢測試劑盒(美國BD公司)；CCK-8、ROS、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(上海碧云天有限公司)；SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(日本TaKaRa公司)；TaqManTMMicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taqman 2× universal PCR Master Mix試劑盒(美國Applied Biosystems公司)；雙熒光素酶報告試劑盒(美國Promega公司)；pcDNA3.1載體質(zhì)粒和lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；miR-22 inhibitor、lncRNA-MIAT inhibitor及其相應(yīng)的陰性對照品均由上海吉瑪基因公司合成；免疫印跡一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)、p-p38 MAPK、 p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p-JNK(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞株 HLE-B3用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。合成三個針對第5個外顯子區(qū)域上不同位置的不同lncRNA-MIAT siRNA，包括M1(靶位點6488-6508)、M2(靶位點7222-7242)和M3(靶位點9735-9755)。對照細(xì)胞接受陰性對照siRNA。siRNA非特異性陰性序列:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；lncRNA-MIAT siRNA M1：5’-GGUGUUAAGACUUGGUUUCTT-3’；lncRNA-MIAT siRNA M2：5’-ACUUCUUCGUAUGUUCGGCTT-3’；lncRNA-MIAT siRNA M3：5’-CAGCAGTTGAGGGTTTGCTGTGTAT-3’。將si-MIAT連接到pcDNA3.1質(zhì)粒中，構(gòu)建穩(wěn)定敲除lncRNA-MIAT的載體。在脂質(zhì)體3000試劑的協(xié)助下，將pcDNA3.1空載體或si-MIAT轉(zhuǎn)染到HLE-B3細(xì)胞中。加入含0.5 g·L-1G418(遺傳霉素)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)4周后，獲得穩(wěn)定沉默lncRNA-MIAT表達(dá)的細(xì)胞系。另外用LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染miR-22 inhibitor或NC-inhibitor。隨后實驗中，收集轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞用于檢測。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理將生長良好的HLE-B3細(xì)胞分為：空白對照組、H2O2組、陰性對照組、si-MIAT組、si-MIAT+miR-22 inhibitor組?？瞻讓φ战M：細(xì)胞不做特殊處理；陰性對照組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒；si-MIAT組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-si-MIAT沉默lncRNA-MIAT表達(dá)；si-MIAT+miR-22 inhibitor組：獲得穩(wěn)定沉默lncRNA-MIAT表達(dá)的細(xì)胞系(轉(zhuǎn)染步驟同si-MIAT組)后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-22 inhibitor。除空白對照組細(xì)胞外，其余各組細(xì)胞處理完成后用適宜濃度H2O2(根據(jù)H2O2誘導(dǎo)實驗結(jié)果，100 μmol·L-1時，HLE-B3細(xì)胞凋亡率約50%)培養(yǎng)12 h。

1.2.3 RT-qPCR檢測各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-MIAT和miR-22表達(dá)采用TRIzol試劑盒提取總RNA。下游分析使用260 nm處光密度(D)值和280 nm處D值比值為1.80～2.20的RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將每個樣本中的1 μg RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的熱循環(huán)程序為16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min。隨后，用PCR擴(kuò)增試劑盒和特異性引物配制PCR反應(yīng)體系，在cFX384 Touch實時PCR檢測系統(tǒng)中對mRNA表達(dá)水平進(jìn)行擴(kuò)增量化，PCR擴(kuò)增熱循環(huán)條件為95 ℃ 1個循環(huán)10 min，然后再95 ℃ 40個循環(huán)15 s和60 ℃ 1 min。使用GAPDH或小分子U6作為內(nèi)部控制。使用2-ΔΔCt法分析表達(dá)水平。lncRNA-MIAT的正向引物為5’-ACGGGGATAGAAGCTGTCCT-3’，反向引物為5’-CTAACGCCCTCTAGCTCCG-3’，大小436 bp；GAPDH 正向引物為 5’-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3’，反向引物為5’-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3’，大小582 bp。miR-22的正向引物為5’-GGCAGAGGGCAACAGTTCTT-3’，反向引物為5’-GCTGAGCCGCAGTAGTTCTT-3’，大小84 bp；U6正向引物為5’-GCAGACCGTTCGTCAACCTA-3’，反向引物為5’-AATTCTGTTTGCGGTGCGTC-3’，大小149 bp。

1.2.4 細(xì)胞增殖活性檢測分別使用0 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、75 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1H2O2處理HLE-B3細(xì)胞構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞模型，培養(yǎng)48 h后采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，以確定后續(xù)實驗中最佳H2O2濃度。各組HLE-B3細(xì)胞按每孔103個接種于96 孔板上，分別于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 時加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h后，于490 nm波長下測D值。

1.2.5 細(xì)胞凋亡情況檢測取各組HLE-B3細(xì)胞(0.2×106個)，1000 r·min-1離心5 min后再懸浮于100 μL結(jié)合緩沖液中。依次用5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI孵育。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測收集各組HLE-B3細(xì)胞(0.2×106個)，用細(xì)胞裂解液裂解后取上清，按照試劑盒說明書檢測MDA、SOD 和 GSH-Px的含量。用2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)探針檢測HLE-B3細(xì)胞內(nèi)源性ROS熒光強(qiáng)度。將各組HLE-B3細(xì)胞(5×103個·mL-1)接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h后，加入10 μmol·L-1熒光探針DCFH-DA。在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值(MFI代表細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測為了進(jìn)一步研究lncRNA-MIAT的下游靶點和調(diào)控通路，利用靶區(qū)預(yù)測算法(LncBase Predicted v2.0和miRWalk 3.0)來預(yù)測lncRNA-MIAT與miRNA的相互作用。發(fā)現(xiàn)lncRNA-MIAT包含miR-22的潛在結(jié)合位點。為了進(jìn)一步確定兩個lncRNA的表達(dá)相關(guān)性，進(jìn)行了熒光素酶報告分析。用PCR擴(kuò)增lncRNA-MIAT的3’UTR片段。將PCR產(chǎn)物克隆至緊靠熒光素酶基因序列下游的psiCHECK-2載體中。構(gòu)建含有miR-22突變種子序列的lncRNA-MIAT 3’UTR的psiCHECK-2。所有結(jié)構(gòu)均經(jīng)DNA測序驗證。將HLE-B3細(xì)胞接種至96孔板中，然后與100 ng構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染48 h，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。同樣的方法驗證miR-22與p38的靶向結(jié)合關(guān)系。

1.2.8 RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀實驗RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)實驗使用美國Millipore公司的Magna RIPTMRNA結(jié)合蛋白IP試劑盒，分別在轉(zhuǎn)染有野生型MS2-lncRNA-MIAT或突變型MS2-lncRNA-MIAT的HLE-B3細(xì)胞中加入裂解液(含有蛋白酶抑制劑和RNase抑制劑)進(jìn)行裂解。磁珠與AgO2/IgG抗體在室溫下孵育30～60 min。在4 ℃溫度下用磁珠進(jìn)行免疫沉淀過夜。從磁珠中洗脫RNA蛋白復(fù)合物。用RT-qPCR分析lncRNA-MIAT和miR-22的表達(dá)。

1.2.9 Western blot檢測蛋白表達(dá)用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，按 BCA 試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量。在100 g·L-1NuPAGE Bis-Tris預(yù)制凝膠中按每孔40 μg加入蛋白樣品，進(jìn)行電泳分離。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用50 g·L-1脫脂牛奶封閉1 h，然后用不同的一抗(Bcl-2、BAX、p-p38 MAPK、 p38 MAPK、JNK、p-JNK)在4 ℃孵育過夜。然后加入辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的山羊抗兔IgG(H+L)二級抗體。電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用 SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析和t檢驗。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 H2O2濃度的確定CCK-8檢測結(jié)果顯示，25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、75 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1H2O2處理HLE-B3細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率分別為(92.39±2.18)%、(86.53±2.92)%、(75.41±5.84)%、(52.33±4.92)%、(29.78±3.81)%、(16.83±2.65)%、(15.74±2.20)%。因此，考慮選擇100 μmol·L-1作為H2O2最佳作用濃度。

2.2 各組細(xì)胞lncRNA-MIAT和miR-22的相對表達(dá)量H2O2誘導(dǎo)對HLE-B3細(xì)胞lncRNA-MIAT和miR-22相對表達(dá)量的影響：與空白對照組(lncRNA-MIAT：1.00±0.08；miR-22：1.00±0.06)相比，H2O2組細(xì)胞lncRNA-MIAT相對表達(dá)量(1.58±0.09)升高，而miR-22相對表達(dá)量(0.81±0.07)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.622、5.829，均為P<0.001)。 si-MIAT慢病毒轉(zhuǎn)染效果驗證：空白對照組、陰性對照組、si-MIAT M1組、si-MIAT M2組、si-MIAT M3組HLE-B3細(xì)胞lncRNA-MIAT相對表達(dá)量分別為1.00±0.08、0.98±0.10、0.67±0.06、0.61±0.05、0.40±0.05，各組整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=104.876，P<0.001)；與空白對照組和陰性對照組相比，si-MIAT M1組、si-MIAT M2組、si-MIAT M3組細(xì)胞lncRNA-MIAT相對表達(dá)量均顯著降低，其中si-MIAT M3組細(xì)胞lncRNA-MIAT相對表達(dá)量均低于si-MIAT M1組和si-MIAT M2組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，因此，選擇si-MIAT M3序列構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并用于后續(xù)實驗。miR-22 inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果驗證：空白對照組、陰性對照組、si-MIAT組、si-MIAT+miR-22 inhibitor組細(xì)胞miR-22相對表達(dá)量分別為1.00±0.06、1.01±0.12、1.25±0.09、0.43±0.05，各組整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=114.583，P<0.001)。與空白對照組和陰性對照組相比，si-MIAT組細(xì)胞miR-22相對表達(dá)量顯著升高，而與si-MIAT組相比，si-MIAT+miR-22 inhibitor組細(xì)胞miR-22相對表達(dá)量則明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.3 lncRNA-MIAT低表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞存活影響CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，各組細(xì)胞存活率和凋亡率整體比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=83.175、83.371，均為P<0.001)；與空白對照組相比，H2O2組細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加；與H2O2組和陰性對照+H2O2組相比，si-MIAT+H2O2組細(xì)胞存活率均升高，細(xì)胞凋亡率均降低；而si-MIAT+miR-22 inhibitor+H2O2組細(xì)胞存活率則較si-MIAT+H2O2組顯著降低，細(xì)胞凋亡率較si-MIAT+H2O2組顯著增加；以上各組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表1)。

表1 CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測各組細(xì)胞增殖、凋亡情況

2.4 lncRNA-MIAT低表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響各組細(xì)胞中MDA、ROS、SOD、GSH-Px含量整體比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=68.509、99.491、121.395、63.199，均為P<0.001)。與空白對照組相比，H2O2組細(xì)胞中MDA和ROS含量均顯著升高，SOD、GSH-Px含量顯著降低；與H2O2組相比，si-MIAT+H2O2組細(xì)胞中MDA和ROS含量顯著降低，SOD、GSH-Px含量則顯著升高；si-MIAT+miR-22 inhibitor+H2O2組細(xì)胞中MDA和ROS含量則較si-MIAT+H2O2組顯著升高，SOD、GSH-Px含量則較si-MIAT+H2O2組顯著降低；以上各組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表2)。

2.5 lncRNA-MIAT對miR-22的海綿吸附作用

2.5.1 生物信息學(xué)預(yù)測雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-22的過度表達(dá)可顯著降低HLE-B3細(xì)胞中psiCHECK-2-MIAT-3’UTR的熒光素酶活性(圖1)。為了進(jìn)一步研究lncRNA-MIAT作為miRNA海綿基因的作用機(jī)制，利用在線預(yù)測軟件(TargetScan v7.2)對miR-22的潛在靶基因進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，miR-22存在與p38 mRNA互補序列。通過熒光素酶報告基因分析，熒光素酶活性隨著miR-22的過度表達(dá)而降低(圖1)。

表2 lncRNA-MIAT低表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量的影響

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測HLE-B3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-MIAT/miR-22/p38 MAPK的靶向關(guān)系 A：lncRNA-MIAT和miR-22靶向結(jié)合的雙熒光素酶報告實驗；B：miR-22和p38α靶向結(jié)合的雙熒光素酶報告實驗。

2.5.2 RIP實驗miRNAs以miRNA核糖核蛋白復(fù)合物(miRNPs)的形式存在，其中含有RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物的核心成分AgO2。首先證實H2O2對AgO2蛋白表達(dá)沒有影響(圖2A)，可以用AgO2抗體對HLE-B3細(xì)胞進(jìn)行RIP實驗。RIP實驗檢測結(jié)果表明，lncRNA-MIAT和miR-22相對于IgG免疫沉淀物優(yōu)先富集在含有AgO2蛋白的miRNPs中(圖2B)。此外，在基礎(chǔ)條件和H2O2暴露條件下進(jìn)行了RIP實驗，lncRNA-MIAT在H2O2條件下能與AgO2結(jié)合更多(圖2C)。

2.6 lncRNA-MIAT低表達(dá)抑制p38 MAPK途徑的活化各組細(xì)胞BAX蛋白、Bcl-2蛋白、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值、p-JNK/JNK比值整體比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=416.598、146.193、3497.353、163.989，均為P<0.05)。與空白對照組相比，H2O2組中BAX蛋白、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值、p-JNK/JNK比值顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低；與H2O2組和陰性對照+H2O2組相比，si-MIAT+H2O2組BAX蛋白、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值、p-JNK/JNK比值顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)則相應(yīng)升高；與si-MIAT+H2O2組相比，si-MIAT+miR-22 inhibitor+H2O2組較BAX蛋白、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值、p-JNK/JNK比值均升高，Bcl-2蛋白表達(dá)則相應(yīng)降低；以上各組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表3和圖3)。

圖2 RIP實驗檢測HLE-B3細(xì)胞中AgO2蛋白和IgG蛋白中l(wèi)ncRNA-MIAT和miR-22表達(dá) A：空白對照組和H2O2組AgO2蛋白表達(dá)；B：RIP實驗檢測lncRNA-MIAT和miR-22表達(dá)結(jié)果；C:空白對照組和H2O2組RIP實驗檢測結(jié)果對比。

表3 Western blot檢測各組細(xì)胞中Bcl-2蛋白、BAX蛋白、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值、p-JNK/JNK比值差異

圖3 lncRNA-MIAT低表達(dá)對凋亡相關(guān)蛋白和p38 MAPK途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 A：空白對照組；B：H2O2組；C：陰性對照+H2O2組；D：si-MIAT+H2O2組；E：si-MIAT+miR-22 inhibitor+H2O2組。

3 討論

以往的研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的主要分子機(jī)制，被認(rèn)為是非先天性白內(nèi)障形成的起始因素[5]。本研究確定了lncRNA-MIAT在H2O2誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞凋亡中的作用。經(jīng)體外細(xì)胞實驗結(jié)果表明，敲低lncRNA-MIAT基因表達(dá)后，能夠通過抑制BAX蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制HLE-B3細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑，從而明顯減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

白內(nèi)障是50歲以上人群中常見的眼部疾病，以晶狀體上皮細(xì)胞損傷引起的晶狀體混濁為主要特征。深入了解白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療靶點具有重要的意義。lncRNA-MIAT已被證明可以作為內(nèi)源性競爭RNA與各種miRNA競爭性結(jié)合，從而抑制 miRNA對靶基因的調(diào)控[6]。Li等[7]研究證實，lncRNA-MIAT過表達(dá)可通過miR-211/GDNF軸減少Neuro2A細(xì)胞凋亡，減輕新生大鼠腦組織缺氧缺血性損傷。此外,lncRNA-MIAT屬于miRNA海綿，Ye等[8]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MIAT可通過海綿miR-149-5p來積極調(diào)節(jié)抗吞噬分子CD47的表達(dá)，沉默lncRNA-MIAT表達(dá)，可延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展，減少易損斑塊的大小和提高斑塊的穩(wěn)定性，并且促進(jìn)巨噬細(xì)胞在體內(nèi)外對凋亡細(xì)胞的清除。

然而，目前關(guān)于lncRNA-MIAT在眼科疾病尤其是白內(nèi)障發(fā)生中的研究尚少。白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制包含氧化損傷、細(xì)胞凋亡、免疫代謝損傷和晶狀體蛋白變性等[9]。其中，晶狀體上皮細(xì)胞的氧化損傷和細(xì)胞凋亡機(jī)制是這一領(lǐng)域的研究熱點。晶狀體上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能對于維持晶狀體的透明度至關(guān)重要，細(xì)胞凋亡是一個重要的病理生理過程，它導(dǎo)致細(xì)胞膜的破壞和染色體的凝聚。BAX和Bcl-2在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HLE-B3細(xì)胞經(jīng)H2O2損傷后ROS含量顯著上升，同時細(xì)胞凋亡率和BAX蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而導(dǎo)致HLE-B3細(xì)胞存活率降低，說明H2O2可誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞損傷。汪靜[10]研究表明晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的病理基礎(chǔ)。細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而對晶狀體上皮細(xì)胞造成結(jié)構(gòu)改變及凋亡等一系列損傷，最終導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。

此外，我們還發(fā)現(xiàn),經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后HLE-B3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-MIAT相對表達(dá)量升高，說明lncRNA-MIAT在H2O2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中發(fā)揮著重要作用。而且我們通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抑制了lncRNA-MIAT基因在HLE-B3細(xì)胞中的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率顯著降低，同時增殖活性增強(qiáng)，說明敲低lncRNA-MIAT表達(dá)可以明顯減輕H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞損傷。目前人們普遍認(rèn)為，很多l(xiāng)ncRNAs扮演著海綿miRNAs的角色，進(jìn)一步從翻譯抑制和(或)降解中釋放miRNAs的下游靶標(biāo)[11]。同樣lncRNA-MIAT的ceRNA活性也可能使它能夠吸收許多miRNAs，進(jìn)而進(jìn)一步作用于下游多個基因。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MIAT在體外可通過海綿 miR-128-3p上調(diào)VEGF表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展。Huang等[13]研究也發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MIAT可以通過海綿miR-214促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，從而為肝癌的治療和預(yù)后提供了新的靶點。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-MIAT通過吸收miR-22激活p38 MAPK/JNK通路，進(jìn)而影響H2O2誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激過程。說明lncRNA-MIAT對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞損傷的作用機(jī)制與對癌細(xì)胞的影響并不完全一致。lncRNA-MIAT對miR-22有一定的吸附作用，而miR-22則又是p38 MAKP信號通路的上游靶標(biāo)。雙熒光素酶報告實驗也證實 miR-22同時與lncRNA-MIAT和p38ɑ結(jié)合，特別是敲低lncRNA-MIAT表達(dá)后可以挽救miR-22和p38ɑ之間的相互作用。所有的真核細(xì)胞都能表達(dá)MAPK，MAPK是信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者[14]。p38 MAPK是一個相對保守的絲氨酸/蘇氨酸絲裂原活化蛋白激酶，在各種細(xì)胞外刺激下能夠被激活，促使底物和腺嘌呤核苷三磷酸結(jié)合，從而參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長和分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞死亡等眾多生物學(xué)功能[15]。上述實驗結(jié)果說明lncRNA-MIAT和p38ɑ與miR-22具有相同的miRNA反應(yīng)元件，這可能是lncRNA-MIAT影響H2O2誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要機(jī)制。

綜上，H2O2誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的同時也導(dǎo)致lncRNA-MIAT表達(dá)上調(diào)，lncRNA-MIAT可海綿吸附miR-22，因此，敲低lncRNA-MIAT表達(dá)后，通過上調(diào)miR-22表達(dá)進(jìn)而抑制p38 MAPK/JNK通路活化，從而抑制H2O2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。