楊大業(yè) 唐世磊 李宏武

中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院 (遼寧 沈陽, 110032)

原發(fā)性肝癌(肝癌)是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、進展快、惡性程度高、生存期短等特點。全球每年新發(fā)的原發(fā)性肝癌病例約為78萬例，死亡約74萬例,其中超過一半發(fā)生在我國[1,2]，手術、放化療雖能在一定程度上改善肝癌患者的預后,但許多患者在確診時就已經失去了最佳治療時機。因此，研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子學機制將有助于探尋肝癌的早期診斷與治療的新靶點。

自噬是細胞通過溶酶體或液泡分解自身組分,以達到維持細胞內正常生理活動和穩(wěn)態(tài)的一種細胞代謝過程[3]。研究表明,自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯(lián)系。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中能夠通過降解細胞器和蛋白質等為腫瘤細胞提供生長所需[4]。腫瘤的存活與增殖可能通過自噬調節(jié)腫瘤與腫瘤微環(huán)境因素的相互關系來實現(xiàn)。因此,通過促進或者抑制自噬從而治療腫瘤,已經成為攻克腫瘤的新思路[5]。

由于RABs在介導腫瘤自噬及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,因此關于RABs在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用已經成為研究的熱點。本實驗通過蛋白免疫印跡技術(Western Blot)檢測 RAB10蛋白在肝癌組織及正常肝組織中的表達情況,并對RAB10的表達差異與肝癌患者臨床病理資料進行相關性分析，以初步探討RAB10在肝癌組織中表達的意義以及可能的作用調控機制。

1 資料與方法

1.1 人體組織標本 65例人肝癌組織及其配對正常肝組織由2012年1月至2015年1月于中國醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院確診為肝癌經手術治療并經患者簽署知情同意書后取得。所有患者術前均未接受化療及放療。65例中,男46例,女19例;年齡33～78歲,中位年齡62歲,其中40例≤60歲,25例>60歲;腫瘤直徑≤3 cm 37例,>3 cm 28例;術中或術后病理提示有淋巴結 轉移癌者20例,無淋巴結轉移癌者45例。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期標準[6]進行分期：Ⅰ期+Ⅱ期39例,Ⅲ期+Ⅳ期26例。取肝癌標本同時取正常肝組織標本(距離腫瘤>2 cm) 作為對照。肝癌組織及正常組織標本切除后立即應用液氮冷凍儲存以供蛋白提取以及免疫印跡實驗(Westernblot)。組織病理學評估均由兩位高年資病理醫(yī)生獨立觀察, 確診為肝細胞癌并復查無誤。所有標本檢測均經患者及其家屬同意,并簽署知情同意書。

1.2 Western Blot實驗 取蛋白樣品30 μg放0.5 ml Ep管內，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×，混勻后于沸水煮沸5 min使蛋白變性。取蛋白上樣進行SDS-PAGE,以內參GAPHDH作為蛋白上樣量標準品。配置10%分離膠和4%濃縮膠進行電泳。恒壓100 V，120 min。轉膜結束后，小心取出膜至干凈的玻璃瓶皿內，以TBST緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl和0.05%Tween 20)洗5 min×3次，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液4度封閉過夜。棄去封閉液，TBST洗5 min×3次，加入抗RAB10多克隆抗體(1∶1 000，Abcom公司)，抗GAPDH 多克隆抗體(1∶2 000,Sigma公司),置4℃過夜。TBST搖床清洗5 min×5次,最后加入HRP標記的相應二抗,采用底物增強化學發(fā)光ECL法顯色,并利用軟件Quantity One(BIO-RAD 公司)進行灰度分析。

1.3 TCGA數(shù)據(jù)庫 通過GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中RAB10在肝癌組織與正常肝臟組織中的表達數(shù)據(jù)并分析RAB10的表達與無病生存期(DFS)、總生存期(OS)的關系[7]。此外，我們通過基因表達的相關性分析，分析自噬相關基因(ATG)家族成員在肝癌中與RAB10表達的相關性，篩選出與RAB10高表達明顯相關的ATG蛋白。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件和GEPIA生存分析功能。RAB10表達水平與各臨床病理參數(shù)關系分析采用χ2檢驗;RAB10表達與肝癌患者OS、DFS之間的關系采用Kaplan-Meier法分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RAB10蛋白在人肝癌組織和正常肝臟組織中的表達水平測定 Western Blot結果顯示, RAB10蛋白在人肝癌和對應的正常肝臟組織中均有表達,但在肝癌中的相對表達水平高于正常組織,見圖 1。

2.2 RAB10的表達與肝癌患者臨床病理參數(shù)的相關性分析 根據(jù)Western Blot結果顯示的RAB10在肝癌中的表達情況,65例肝癌患者分為兩組:RAB10高表達組(n=35)和低RAB10表達組(n=30)。表1所示高RAB10表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期顯著相關(P<0.05),而與年齡、性別無相關性。

圖1 RAB10蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達圖

表1 肝癌組織中RAB10的表達與患者臨床病理參數(shù)的關系

2.3 RAB10的表達與肝癌患者生存時間的關系 使用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌患者的表達數(shù)據(jù)并分析RAB10的表達對患者OS、DFS的影響。圖2顯示, RAB10在不同分期肝癌中相對表達量存在顯著差異(P<0.001)，RAB10的表達量越多，腫瘤分期越高。更重要的是,RAB10高表達患者的OS和DFS顯著低于RAB10低表達者,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05),見圖3。

圖2 RAB10在不同分期肝癌中相對表達量圖

圖3 不同RAB10表達水平的肝癌患者的OS及DFS

2.4 RAB10的表達與ATG表達的相關性 在肝癌組織中，RAB10的高表達與ATG3、ATG5、ATG6、ATG7的高表達呈明顯的正相關(P<0.001)。相關系數(shù)分別為0.7、0.61、0.6、0.63，其中RAB10的高表達與ATG3的表達情況相關性最強，見圖4。

圖4 RAB10的表達與ATG3、ATG5、ATG6、ATG7表達的相關性

3 討論

RAB10屬于小型RabGTPase的一種，它作為Ras超家族單體G蛋白的一部分,以在膜轉運活動中擔任主配位體而被人熟知[8]。近來研究發(fā)現(xiàn)，RAB10可參與細胞成分物質運輸、內吞循環(huán)、內質網(wǎng)小管形態(tài)及動力調節(jié)等自噬過程[9-11]，尤其在脂質吞噬(脂噬)中發(fā)揮活躍作用[12]。近來關于RAB10在惡性腫瘤中的表達情況已有相關報道，RAB10在肝癌、骨肉瘤、食管鱗癌等惡性腫瘤中可促進腫瘤的增殖和侵襲，這種效應可被microRNA抑制[13-15]。因此，RAB10與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。

本研究選擇了配對的65例肝癌組織和正常肝組織作為研究對象，結果顯示,RAB10蛋白在肝癌組織中的表達顯著高于正常肝組織(P<0.05),這說明RAB10蛋白的表達與肝癌關系密切。結合TCGA數(shù)據(jù)庫的182對肝癌患者RAB10的表達情況對患者OS、DFS的影響來看，RAB10在肝癌組織中的表達顯著高于正常肝組織,且RAB10在不同分期肝癌中相對表達量存在顯著差異，分期越高，RAB10的相對表達量也越高，因此RAB10可能參與肝癌異型性的調控。這似乎提示RAB10在肝癌中的高表達可促進惡性細胞的侵襲轉移,其表達增加時肝癌更易于復發(fā)轉移，從而導致預后不良。

鑒于RAB10在腫瘤自噬，尤其是脂噬過程中發(fā)揮的重要作用，我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選了肝癌中與RAB10表達明顯相關的ATG。結果發(fā)現(xiàn)，RAB10與ATG3、ATG5、ATG6、ATG7表達呈明顯的正相關，其中與ATG3最相關(R=0.7)，這說明RAB10與ATG之間可能存在某種關系的調控機制，這有待于嚴謹?shù)募毎麑W實驗研究來驗證和豐富。