巫智勇 葉 英

安徽省合肥市安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (安徽 合肥， 230032)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我國極為重要的公共衛(wèi)生問題。HBV DNA的復(fù)制是乙肝病情進(jìn)展的主要原因，采用PCR方法定量檢測HBV DNA對慢性乙型肝炎的診斷、治療和預(yù)后判斷具有重要意義[1]。Cobas系統(tǒng)是Roche公司研制的用于核酸檢測的實時熒光定量PCR方法，其檢測的下限可達(dá)到20 IU/ml，上限為1.7×108IU/ml，定量線性范圍較廣。2007年美國即推薦使用Cobas試劑作為HBV DNA檢測的方法，然而這種國際公認(rèn)的HBV DNA精準(zhǔn)定量的檢測方法，由于其試劑價格昂貴，且必須采用Roche公司專用PCR儀，故在我國難以廣泛使用。目前國內(nèi)大多采用國產(chǎn)試劑檢測HBV DNA，國產(chǎn)試劑的檢測下限一般均為1 000 copy/ml。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，病毒低水平復(fù)制與疾病進(jìn)展關(guān)系密切。慢乙肝患者經(jīng)過長期抗病毒治療，血清中HBV沒有<20 IU/ml時，會導(dǎo)致肝臟疾病繼續(xù)進(jìn)展，甚至發(fā)生HCC[2]。Choi等[3]研究進(jìn)一步證明了核苷類藥物治療必須將血清DNA降得越低越好。本研究對未經(jīng)和已經(jīng)進(jìn)行核苷類藥物抗病毒治療的乙型肝炎患者，進(jìn)行了Cobas和國產(chǎn)試劑的同步檢測，以了解兩者檢測精度的差異，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 血清標(biāo)本 先后收集安徽醫(yī)科大學(xué)一附院2019年3月至2019年6月期間門診和住院的未經(jīng)和已經(jīng)進(jìn)行核苷類藥物治療的慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化患者血清70份，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、感染病學(xué)分會制定的2019版《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。標(biāo)本均系空腹采取，2小時內(nèi)分離血清并置于-20℃低溫冰箱保存。

1.2 HBV DNA定量檢測 HBV DNA分別用Cobas定量試劑(Roche)和上海之江生物科技股份有限公司試劑(ZJ)進(jìn)行檢測。所有試劑均有正式批文，批檢合格并在有效期內(nèi)使用，擴增反應(yīng)分別在Cobas TaqMan 48 PCR儀和美國Applied Biosystem公司生產(chǎn)的ABI 7500基因擴增儀進(jìn)行。同一份標(biāo)本采用2種試劑進(jìn)行平行檢測，具體操作和結(jié)果判定參照試劑盒說明進(jìn)行。Roche結(jié)果電腦自動設(shè)置的單位為IU/ml，ZJ試劑單位為copy/ml，為便于比較，根據(jù)Roche的換算值：1 IU/ml=5.83 copy/ml，將單位為IU/ml的結(jié)果換算為copy/ml為單位，如20 IU/ml=116 copy/ml。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)分析采用t檢驗、相關(guān)分析和χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 采用Roche試劑對70份標(biāo)本的檢測結(jié)果 70份標(biāo)本進(jìn)行Roche HBV DNA檢測，其中處于Roche檢測下限(≤116 copy/ml)的標(biāo)本有17份，大于Roche檢測上限(≥9.91×108copy/ml)的標(biāo)本有6份，余下的47份均檢測出具體的HBV載量，病毒載量在102～103，103～104，104～105，105～106，107～108，108～大于9.91×108(copy/ml)范圍內(nèi)的標(biāo)本數(shù)分別為：10，9，6，9，5，6，2份。

2.2 采用國產(chǎn)ZJ試劑對70份標(biāo)本的檢測結(jié)果 處于檢測下限(≤1 000 copy/ml)的有43份，余下的27份均檢測出具體的HBV載量，其中病毒載量在103～104，104～105，105～106，107～108，108～109，109以上(copy/ml)范圍內(nèi)的標(biāo)本數(shù)分別為：3，5，3，6，6，3，1份。

2.3 ZJ檢測結(jié)果與Roche檢測結(jié)果的相關(guān)性分析 由于處于ZJ檢測下限的標(biāo)本有43份，處于Roche檢測下限的標(biāo)本有17份，大于Roche檢測上限的標(biāo)本有6份，這些結(jié)果沒有具體的數(shù)值，不適合做相關(guān)性分析，因此只對其中20份兩種檢測方法均有具體數(shù)值的進(jìn)行相關(guān)性分析。ZJ試劑檢測結(jié)果與Roche檢測結(jié)果的總體相關(guān)系數(shù)r=0.612，P=0.004，說明兩者之間存在顯著的線性相關(guān)(見圖1表示的散點圖)。將標(biāo)本按照病毒載量分級，在病毒載量分別為103～104，104～105，105～106，106～107，107～108，108～109(copy/ml)范圍內(nèi)的標(biāo)本中，國產(chǎn)ZJ試劑檢測結(jié)果與Roche定量結(jié)果的相關(guān)性分別為：-0.081，0.311，-0.081，0.311，0.271，0.387，檢測P值分別為：0.504，0.009，0.504，0.009，0.023，0.001。再按照以下5個范圍內(nèi)的病毒載量分級：103～104，103～105，103～106，103～107，103～108(copy/ml)，國產(chǎn)ZJ試劑檢測結(jié)果與Roche定量結(jié)果的相關(guān)性分別為：-0.129，0.107，0.13，0.304，0.295，檢測P值分別為：0.287，0.378，0.283，0.011，0.013，可見在103107copy/ml范圍以上，兩種檢驗方法間存在顯著的線性相關(guān)。

圖1 Roche試劑檢測結(jié)果與ZJ試劑檢測結(jié)果的相關(guān)性分析(r=0.612，P=0.004)

2.4 ZJ試劑檢測結(jié)果低于檢測下限的與Roche檢測結(jié)果的比較 采用ZJ試劑檢測結(jié)果陰性(低于檢測下限)的標(biāo)本有43份，應(yīng)用Roche定量檢測結(jié)果分別為：處于檢測下限(≤116 copy/ml)的標(biāo)本有17份，占39.5%；處于102～103的標(biāo)本有10份，占23.3%；處于103～104的標(biāo)本有9份，占20.9%；處于104～105的標(biāo)本有2份，占4.7%；處于105～106范圍內(nèi)的標(biāo)本有5份，占11.6%。共26份(60.5%)的病毒載量在106 copy/ml 范圍的標(biāo)本ZJ檢測為低于檢測下限，ZJ試劑檢測結(jié)果低于檢測下限的與Roche檢測結(jié)果的比較如圖2所示。ZJ試劑檢測結(jié)果≤1 000 copy/ml而Roche檢測結(jié)果>1 000 copy/ml的，即ZJ試劑檢測結(jié)果呈假陰性的標(biāo)本有16例，占37.2%。

圖2 國產(chǎn)HBV DNA陰性患者43例采用羅氏HBV DNA檢測分布圖

3 討論

對全部標(biāo)本的檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性比較，結(jié)果顯示，ZJ試劑與Roche試劑具有較好的相關(guān)性(r=0.612，P=0.004)，表明國產(chǎn)試劑總體來說反映了標(biāo)本中的病毒載量水平，可以用于常規(guī)檢測。將檢測結(jié)果按不同HBV DNA拷貝水平進(jìn)行分組分析，發(fā)現(xiàn)ZJ試劑僅與病毒載量在107copy/ml以上的標(biāo)本具有較好的相關(guān)性，而病毒載量低于≤106copy/ml范圍內(nèi)的標(biāo)本相關(guān)性差，沒有統(tǒng)計學(xué)意義，這與薛艷等報道相似[5，6]。國產(chǎn)試劑對于病毒載量低于106copy/ml 的標(biāo)本檢測結(jié)果的問題突出體現(xiàn)在三個方面：①檢測結(jié)果準(zhǔn)確性差；②相當(dāng)比例的標(biāo)本國產(chǎn)試劑出現(xiàn)檢測值≤1 000 copy/ml，病毒載量越低，出現(xiàn)檢測值低于下限值的比例越高。本研究中國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果陰性的標(biāo)本有43份，而Roche檢測真正檢測不到的標(biāo)本僅17份(39.5%)，余下的標(biāo)本26份(60.5%)均檢測到病毒載量，波動范圍為在102～106copy/ml，其中，在病毒載量處于102～104copy/ml的標(biāo)本有19份，占44.2%；③病毒載量低于106copy/ml的標(biāo)本，國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果的重復(fù)性差，同一標(biāo)本不同批次的檢測結(jié)果可以相差1個數(shù)量級。上述缺點，使得ZJ試劑對于接受抗病毒治療后的個體由于體內(nèi)病毒載量處于低水平而不能準(zhǔn)確的監(jiān)測，從而不能幫助醫(yī)生準(zhǔn)確判斷乙肝抗病毒治療的關(guān)鍵時間點如第24周或48周的療效，以及在長期抗病毒治療中不能夠?qū)⒉《窘档皆降驮胶脧亩鴾p少肝癌發(fā)生的要求。2019年慢性乙型肝炎防治指南指出，只要HBV DNA陽性，不論載量高低，合并有肝臟損傷時，就需立即抗病毒治療[4]。部分患者由于國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果的精度問題，延誤了治療而出現(xiàn)病情進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)ZJ試劑檢測結(jié)果≤1 000 copy/ml而Roche檢測結(jié)果>1 000 copy/ml的標(biāo)本有16份，占ZJ試劑檢測結(jié)果呈陰性的43份標(biāo)本的37.2%。這種假陰性的發(fā)生可能是病毒變異或不同基因型的病毒感染造成的特異性引物或探針結(jié)合區(qū)不能有效結(jié)合，無法水解探針激發(fā)熒光有關(guān)，鑒別這種假陰性可以參考HBV血清學(xué)和肝功能檢測結(jié)果，或進(jìn)行HBV DNA復(fù)測。若無Roche檢測，則通過應(yīng)用國內(nèi)不同廠家(主要是引物和探針不同)的試劑進(jìn)行平行檢測而確定[7，8]。ZJ試劑檢測結(jié)果呈陰性而Roche檢測結(jié)果處于102～103copy/ml的有10份，占ZJ試劑檢測結(jié)果呈陰性的43份標(biāo)本的23.3%，這種假陰性的發(fā)生可能與Roche檢測病毒載量在103copy/ml 以上的標(biāo)本的假陰性不完全相同，這主要因Cobas TaqMan Amplicor系統(tǒng)有以下兩個特性：①在引物和探針設(shè)計上，選擇適合所有不同基因型HBV的檢測；②設(shè)立內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品(QS)的管內(nèi)質(zhì)控，一方面用于定量，另一方面監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程。QS是已知拷貝數(shù)的人工構(gòu)建核酸，與靶核酸序列相同，加入每一個樣本中，與樣本一同提取、擴增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線對靶核酸進(jìn)行定量，與國產(chǎn)試劑采用的傳統(tǒng)外標(biāo)法定量相比，內(nèi)標(biāo)法完全消除由于核酸提取、擴增效率不同而造成的管間差異，定量結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，而且QS參與從核酸提取到熒光定量PCR整個實驗流程，可避免由于反應(yīng)抑制造成的假陰性結(jié)果，也避免了溶血、脂血和黃疸等對PCR結(jié)果的干擾?；谶@些特性，Cobas系統(tǒng)是精準(zhǔn)度最高的病毒檢測儀，成為國際上檢測HBV DNA 的金標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)以上研究結(jié)果，建議對于HBV DNA低于106copy/ml的標(biāo)本，尤其是經(jīng)過抗病毒治療后國產(chǎn)檢測低于檢測下限的，應(yīng)采用Cobas高精度病毒載量檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測或復(fù)測，避免假陰性結(jié)果而延誤病情，從而讓患者得到更有效、更有價值的治療，提高肝炎患者的治療效果和生活質(zhì)量。