蔣肖, 涂濤, 王坤, 彤麗格, 羅會穎

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081)

海藻糖是一類非還原型二糖，由兩個α-D-葡萄糖通過α-1,1-糖苷鍵連接而成，通常以二水化合物的形式存在，是所有糖中化學(xué)性最不活躍的糖[1]。它廣泛存在于細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物及藻類等生物體內(nèi)，可以起到為生物體提供碳源，以及提高細(xì)胞耐受性的作用[2]。

海藻糖酶(trehalase，EC3.2.1.28)可以將海藻糖水解產(chǎn)生兩分子的葡萄糖。海藻糖酶廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，目前已經(jīng)從多種生物體內(nèi)分離出來了海藻糖酶基因。根據(jù)氨基酸序列相似性、結(jié)構(gòu)相似性等特點(diǎn)，海藻糖酶在碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZy)數(shù)據(jù)庫中，被歸類到糖苷水解酶(glucoside hydrolase, GH)第15、37和65家族[3-4]。除了畢赤酵母通過海藻糖磷酸化酶分解海藻糖以外，其他真菌系統(tǒng)中都是通過海藻糖酶分解海藻糖，并且對海藻糖具有嚴(yán)格的底物專一性?；诤Ｔ逄敲傅拇呋攸c(diǎn)，海藻糖酶可以廣泛應(yīng)用于淀粉多糖制備、食品、臨床醫(yī)療和害蟲防治等生物工業(yè)中[2,5]。丁春磊[6]研究表明，在燃料乙醇生產(chǎn)過程中，添加海藻糖酶可有效提高乙醇的產(chǎn)率，改善酵母的健康狀態(tài)，降低生產(chǎn)成本。劉迎春等[7]對金龜子綠僵菌中的海藻糖酶ReATM1p進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)鑒定和基因敲除等研究，進(jìn)一步證明了海藻糖酶在害蟲生物防治中的應(yīng)用價值。韓雋等[8]研究表明，谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的后期加入海藻糖酶可以提高糖酸轉(zhuǎn)化率的效果，進(jìn)而提高谷氨酸的生產(chǎn)量。

根據(jù)海藻糖酶酶促反應(yīng)的最適pH不同，可以將真菌海藻糖酶分為酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶[9]。真菌中性海藻糖酶的最適pH為7.0，通常位于細(xì)胞胞質(zhì)中，其酶活性受轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的影響；酸性海藻糖酶最適pH為3.5～6.0，是一種外分泌性糖蛋白，主要位于液泡、細(xì)胞壁或者分泌到胞外[9]。除此之外，還有一種源于嗜熱真菌的海藻糖酶，既具有酸性海藻糖酶最適pH反應(yīng)條件的特點(diǎn)，又具備中性海藻糖酶可被Ca2+或Mn2+激活和被ATP抑制的特點(diǎn)[10-12]。目前，多種性質(zhì)優(yōu)良的糖苷水解酶基因資源被成功挖掘并報(bào)道，如最適pH為1.5的甘露聚糖酶[14]、最適pH為4.5的木聚糖酶[15]和最適pH為5.0的葡聚糖酶[16]等，人們研究最為清晰的是釀酒酵母中的酸性海藻糖酶。

Bisporasp. MEY-1菌株為本實(shí)驗(yàn)室從酸礦中分離的一株嗜酸真菌，在pH 2.5～3.0的環(huán)境中生長情況最好[13]。本研究從嗜酸真菌Bisporasp. MEY-1中克隆了一個海藻糖酶基因TreA并在畢赤酵母GS115中成功實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，通過對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，以期獲得可以應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)的海藻糖酶，進(jìn)而豐富海藻糖酶資源。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及試劑

Bisporasp. MEY-1菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離，保存在中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection, CGMCC)，登記號為CGMCC250027。Bisporasp. MEY-1的活化和培養(yǎng)條件參照李燁青等[17]方法?；蚩寺∵^程中間載體為pEASY-T3，克隆宿主為大腸桿菌感受態(tài)EscherichiacoliTrans-T1，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。海藻糖酶基因TreA外源表達(dá)用的載體為pPIC9，表達(dá)宿主為畢赤酵母GS115，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)中所用的總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司；細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ,NotⅠ購自TaKaRa有限公司；高保真DNA聚合酶Fast pfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑，如甲醇、乙醇和乙酸等試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)中所用到的培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、MD培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、BMMY及BMGY培養(yǎng)基，其詳細(xì)配制參照李曉麗等[18]方法；海藻糖酶酶活性測定所用的DNS試劑配制參照李燁青等[17]方法。

1.3 海藻糖酶基因TreA序列分析

根據(jù)嗜酸菌株Bisporasp. MEY-1的全基因組序列測序結(jié)果，查找到一個新的海藻糖酶基因TreA，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先，將序列提交給在線網(wǎng)站Softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測基因的內(nèi)含子和外顯子，SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測編碼蛋白質(zhì)信號肽的序列。然后利用Vector NTI Advance 10.0軟件將基因翻譯為氨基酸序列后，分析其氨基酸序列的長度、蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量。最后，將氨基酸序列提交到Expasy.PI(https://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測新海藻糖酶TreA的等電點(diǎn)。

1.4 海藻糖酶基因TreA克隆與畢赤酵母重組載體構(gòu)建

將嗜酸菌株Bisporasp. MEY-1在PDB培養(yǎng)基、30 ℃培養(yǎng)條件下活化48 h后，轉(zhuǎn)接到以海藻糖為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于30 ℃、210 r·min-1震蕩培養(yǎng)2～3 d，12 000 r·min-1離心10 min收集菌體。根據(jù)真菌總 RNA 提取試劑盒說明書提取菌體的總RNA，然后再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Rever Tra Ace-a-TM kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)去除信號肽序列的全長基因設(shè)計(jì)引物(F: 5′-GCTGAATTCTACGTAGAATTCAAGA-TATATTCGACT-3′；R: 5′-CGAATTAATTCGC-CGGCGGCTCAAATAACCAAGG-3′)(橫線標(biāo)注分別為限制性酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和NotⅠ)，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，利用T4 DNA連接酶將其連入載體pPIC9后熱擊轉(zhuǎn)化Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽性克隆子送測序公司測序，測序正確的重組載體命名為pPIC9-TreA。

1.5 海藻糖酶TreA在畢赤酵母中的表達(dá)及純化

利用質(zhì)粒小提試劑盒提取測序正確的pPIC9-TreA質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶BglⅡ?qū)⑵渚€性化后，回收產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)化子涂布于MD平板，在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后挑取48個克隆子于含有3 mL BMGY培養(yǎng)基的離心管中震蕩培養(yǎng)(30 ℃，220 r·min-1)；培養(yǎng)48 h后，4 500 r·min-1離心5 min，將菌體重懸于1 mL含有0.5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h。最后，通過酶活性測定獲得陽性克隆子進(jìn)行搖瓶放大培養(yǎng)。

將篩選的陽性克隆子在YPD培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)72 h，按1%的接種量接種于400 mL BMGY培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)48 h后，4 500 r·min-1離心5 min收集菌體轉(zhuǎn)入200 mL BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h，每隔24 h補(bǔ)加0.5%甲醇。

誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，12 000 r·min-1離心5 min收集發(fā)酵液。將200 mL發(fā)酵液經(jīng)10 kD膜包(Vivascience, Germany)濃縮至15 mL后，發(fā)酵液于pH 7.0、10 mmol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中過夜透析。然后，將透析過的酶液通過陰離子純化柱(HiTrap Q HP)進(jìn)行純化，收集不同濃度鹽離子洗脫下來的蛋白，并通過SDS-PAGE分析確定純化的單一條帶。

1.6 海藻糖酶TreA酶活性測定

海藻糖酶的酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)法檢測還原糖生成量進(jìn)行活性分析。具體方法如下：在pH 4.0、60 ℃條件下，1 mL的反應(yīng)體系包括100 μL酶液和900 μL 1%的海藻糖底物，反應(yīng)10 min，加入1.5mL DNS終止反應(yīng)后沸水煮5 min，540 nm下測定OD值。對照組先加終止液，再加酶液。每組三個平行，一個對照。海藻糖酶活性單位定義：在pH 4.0、60 ℃條件下，每分鐘分解海藻糖生成1 μmol還原糖所需要的酶量為1個活性單位(U)。

1.7 海藻糖酶TreA酶學(xué)性質(zhì)測定

測定海藻糖酶最適pH時，將純化的海藻糖酶TreA分別置于60 ℃，不同pH(1.0～12.0，其中pH 1.0～3.0是0.1 mol·L-1甘氨酸-HCl緩沖液；pH 3.0～9.0是0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；pH 9.0～12.0是0.1 mol·L-1NaOH-甘氨酸緩沖液)底物條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)。測定海藻糖酶TreA的pH穩(wěn)定性時，純海藻糖酶TreA酶液在不同pH 1.0～12.0緩沖液稀釋后置于37 ℃恒溫水浴鍋中處理1 h，然后在pH 4.0、60 ℃條件下測定其相對剩余酶活，未進(jìn)行處理酶活為100%對照。

測定海藻糖酶的最適溫度時，純化的海藻糖酶TreA分別在20～90 ℃范圍內(nèi)，pH 4.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)。測定海藻糖酶TreA的熱穩(wěn)定性時，純化的海藻糖酶TreA分別在60、65和70 ℃恒溫水浴鍋中分別處理0、2、5、10、15、20、30和60 min后，在pH 4.0、60 °C條件下測定其剩余酶活力，未進(jìn)行處理的酶活為100%對照。

分別利用pH 4.0、0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制不同濃度(0.5～10 mg·mL-1)的海藻糖作為反應(yīng)底物。將純化的海藻糖酶TreA稀釋至合適的濃度分別在不同濃度的底物中反應(yīng)5 min(pH 4.0、60 ℃)，測定其酶活性。將測定的酶活數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 5.01軟件分析，獲得海藻糖酶TreA的Vmax和Km。

1.8 不同金屬離子或化學(xué)試劑對酶活力的影響

在海藻糖底物中分別添加NaCl、LiCl、KCl、AgNO3、HgCl2、MgCl2、MnCl2、Pb(CH3COO)2、NiCl2、ZnCl2、CoCl2、CuCl2、CaCl2、CrCl3、FeCl3、SDS、EDTA，和β-巰基乙醇共18種物質(zhì)，使其終濃度為5和10 mmol·L-1。然后，在pH 4.0、60 ℃條件下分別測定海藻糖酶在不同底物中的剩余酶活力。以未添加任何物質(zhì)的反應(yīng)體系為對照組，計(jì)算處理后海藻糖酶TreA的相對剩余酶活，評估各種金屬離子和化學(xué)試劑對海藻糖酶TreA酶活力的影響，每組反應(yīng)設(shè)計(jì)三個重復(fù)。

1.9 海藻糖酶TreA的蛋白酶抗性評估

在純化的海藻糖酶TreA中分別添加胰蛋白酶、蛋白酶K、膠原蛋白酶、糜蛋白酶、枯草蛋白酶和胃蛋白酶，使其終濃度為0.1 mg·mL-1，然后將其置于37 ℃恒溫水浴鍋中分別處理0、30和60 min。在pH 4.0、60 ℃條件下測定其相對剩余酶活，以未添加蛋白酶的反應(yīng)體系為對照組，來評估海藻糖酶TreA的蛋白酶抗性。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2018和Origin 2017對測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、計(jì)算和差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖酶基因TreA的克隆與序列分析

從嗜酸菌株Bisporasp. MEY-1的基因組中克隆海藻糖酶基因TreA，其cDNA全長序列為3 075 bp，可以翻譯編碼1 024個氨基酸。其編碼的氨基酸序列經(jīng)在線網(wǎng)站進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果表明N端的前21個氨基酸為信號肽序列。TreA成熟蛋白的理論分子質(zhì)量為109.6 kD，等電點(diǎn)為4.5，屬于糖苷水解酶32家族。海藻糖酶TreA的氨基酸序列經(jīng)在線網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測，結(jié)果顯示其蛋白質(zhì)表面共有7個潛在N-糖基化位點(diǎn)，分別為Asn117、Asn154、Asn177、Asn217、Asn274、Asn289和Asn564。在氨基酸組成方面，酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)占9.28%；堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸)占4.88%；極性氨基酸(天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸)占34.67%；疏水氨基酸(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸)占34.47%。將TreA的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，該基因與Baudoiniapanamericana來源的海藻糖酶序列最為相似，序列一致性為68.9%，顯示了海藻糖酶基因TreA的新穎性。

2.2 海藻糖酶TreA重組載體的表達(dá)和純化結(jié)果

重組表達(dá)載體pPIC9-TreA在畢赤酵母GS1115中成功表達(dá)，將篩選的陽性克隆子進(jìn)行搖瓶表達(dá)，獲得的發(fā)酵液進(jìn)行后續(xù)的純化處理。粗酶液經(jīng)濃縮、陰離子純化柱純化等一系列處理后，獲得單一純化峰，并將濃縮液、純化液及Endo H處理的純蛋白分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，TreA的目的條帶大小為135 kD左右(圖1)，經(jīng)Endo H脫糖基處理后目的條帶降為110 kD左右，與理論分子質(zhì)量一致。

注：M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的特定理論分子質(zhì)量；1—濃縮后TreA; 2—純化后的TreA; 3—Endo H處理的TreA。Note：M— Molecular weight standard; 1—concentrated TreA with ultrafiltration membrane; 2—Purified TreA; 3—Purified TreA with Endo H.圖1 TreA的SDS-PAGE凝膠電泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified recombinant TreA

2.3 海藻糖酶TreA的酶學(xué)性質(zhì)分析

測定重組海藻糖酶TreA在不同pH緩沖液、50 ℃條件下的酶活性，結(jié)果表明，TreA的最適pH為4.0，在pH 2.2～5.0范圍內(nèi)，該酶能夠維持其60%以上的酶活力，是一種酸性海藻糖酶(圖2A)。TreA在極酸條件下(pH 1.0～3.0)可維持100%的剩余酶活性，pH 4.0～7.0可維持100%的剩余酶活性，隨著pH條件向堿性方向移動，其穩(wěn)定性逐漸減弱(圖2B)。TreA的最適溫度為60 ℃，在40～70 ℃之間都可以剩余50%以上的酶活力(圖2C)，屬于中高溫酶。分析TreA的熱穩(wěn)定性，在60和65 ℃下分別處理60 min，測定處理后酶液的剩余酶活分別為85%和70%，在70 ℃下處理30 min，依然能夠保持40%的酶活力(圖2D)。

A:最適pH；B:pH穩(wěn)定性；C:最適溫度；D:溫度穩(wěn)定性A: Effect of pH on enzyme activities; B: pH stabilities; C: Effect of temperature on enzyme activities; D: Thermostability圖2 重組海藻糖酶TreA的基本酶學(xué)性質(zhì)Fig.2 Characterization of purifird recombinant TreA

以1%海藻糖為底物，在最適條件(pH 4.0、60 ℃)下，重組海藻糖酶TreA的比活為1 913 U·mg-1，動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax分別為0.67 mg·mL-1和119 μmol·min-1·mg-1。

2.4 金屬離子及化學(xué)試劑海藻糖酶TreA的影響

18種金屬離子和化學(xué)試劑對重組海藻糖酶TreA酶活性的影響如表1所示。當(dāng)化學(xué)物質(zhì)濃度為5 mmol·mL-1時，F(xiàn)e3+、Mn2+、Pb2+和巰基乙醇對海藻糖酶起激活作用；SDS、Ag+和Hg2+對海藻糖酶具有抑制作用；Ag+、Na+、K+、Ca2+、SDS和Hg2+均對海藻糖酶TreA的酶活性具有抑制作用。濃度為10 mmol·mL-1時抑制效果較5 mmol·mL-1時更強(qiáng)，其中對海藻糖酶TreA酶活性影響最大的為Ag+，經(jīng)5 mmol·mL-1離子處理后其相對剩余酶活性降為43.5%，經(jīng)10 mmol·mL-1處理后幾乎沒有酶活性。Co2+、Fe3+和β-巰基乙醇可顯著提高海藻糖酶TreA的酶活性，Co2+、Fe3+濃度為5 mmol·mL-1時提高海藻糖酶TreA酶活性效果更加明顯，β-巰基乙醇濃度為10 mmol·mL-1時提高海藻糖酶TreA酶活性效果更加明顯。

2.5 海藻糖酶TreA對蛋白酶的抗性

測定純海藻糖酶TreA在含有0.1 mg·mL-1緩沖液中處理后的相對剩余酶活，如圖3所示，海藻糖酶TreA對胰蛋白酶、膠原蛋白酶和胃蛋白酶具有非常好的蛋白酶抗性，幾乎沒有酶活性的損失。然而，海藻糖酶TreA對蛋白酶K和糜蛋白酶的蛋白酶抗性較差，并且隨著在蛋白酶中處理的時間越長，酶活性損失越嚴(yán)重：海藻糖酶TreA在0.1 mg·mL-1蛋白酶K和糜蛋白酶中處理30 min后，相對剩余酶活分別為80%、40%;處理60 min后相對剩余酶活分別為60%、20%。另外，枯草蛋白酶對海藻糖酶TreA的酶活性也有輕微的抑制作用。

表1 不同金屬離子及化學(xué)試劑下純化重組海藻糖酶TreA活性Table 1 Activities of TreA under different concentration of metal ions and chemical reagents

3 討論

海藻糖酶作為一種常見的生物催化劑，在生物工業(yè)中的應(yīng)用通常需要在酸性條件下進(jìn)行，因此挖掘具有嗜酸特性的海藻糖酶基因具有重要意義。在本研究中，通過基因工程技術(shù)從嗜酸真菌Bisporasp.-MEY-1中成功克隆了一種酸性、耐中高溫的海藻糖酶TreA，其最適pH為4.0，在pH 2.2～5.0范圍內(nèi)，可維持60%以上的剩余酶活力;在pH 1.0～9.0條件下處理1 h，可以維持79%以上的剩余酶活力，在最適pH和pH穩(wěn)定性上具有明顯的優(yōu)勢。目前已有多種真菌來源的酸性海藻糖酶基因被報(bào)道，劉迎春[7]利用RT-PCR、RACE等方法成功地克隆了金龜子綠僵菌的酸性海藻糖酶基因；釀酒酵母Saccharomycescerevisiae[19]、白色念珠菌Candidaalbicans[20]、構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans[21]中也分離鑒定出酸性海藻糖酶基因。此外，在NCBI數(shù)據(jù)庫中還報(bào)道了另外兩種絲狀真菌煙曲霉Aspergillusfumigatus和埃默森籃狀菌Talaromycesemrsonii來源的酸性海藻糖酶疑似基因序列[7]，Bisporasp.-MEY-1來源的酸性海藻糖酶基因TreA與上述幾種來源的海藻糖酶基因的同源性在25%～50%之間。

注：A—胰蛋白酶；B—蛋白酶K；C—膠原蛋白酶；D—糜蛋白酶；E—枯草蛋白酶；F—胃蛋白酶。 * 和**分別表示在P<0.05和P<0.01水平具有顯著性。Note：A—Trypsin; B—Proteinase K; C—Collagenase; D—Chymotrypsin; E—Subtilase; F—Pepsase. * and ** indicate significant difference at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively.圖3 蛋白酶對純化重組海藻糖酶TreA的活性影響Fig.3 Effect of protease on enzyme activities of recombinant TreA

上述真菌來源的酸性海藻糖酶中，已有酶學(xué)性質(zhì)報(bào)道的為來源于金龜子綠僵菌的海藻糖酶ReATM1p，NCBI登錄號為EF190950，與本研究中的酸性海藻糖酶TreA的序列一致性為47.8%。ReATM1p的最適pH為6.0，在pH 4.5～7.5范圍內(nèi)具有較高的酶活力，但是當(dāng)反應(yīng)體系pH超過7.5時，酶活力迅速下降。與本研究中的酸性海藻糖酶TreA的最適pH和pH穩(wěn)定性相比，ReATM1p的酸適應(yīng)性明顯較差[7]。Enfert等[21]發(fā)現(xiàn)，為減少酸性條件下正電荷的積累，許多嗜酸蛋白表面進(jìn)化出大量酸性氨基酸殘基。但是，已有晶體報(bào)道的海藻糖酶與本研究的酸性海藻糖酶TreA序列一致性最高的僅為22%，不滿足同源建模的條件，無法實(shí)現(xiàn)TreA三維結(jié)構(gòu)的可視化分析。分析TreA和ReATM1p的一級結(jié)構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)TreA的氨基酸序列中酸性氨基酸(天冬氨酸Asp和谷氨酸Glu)占9.28%，ReATM1p的氨基酸序列中酸性氨基酸占8.4%。因此，推測可能是TreA中酸性氨基酸的比例明顯高于ReATM1p，導(dǎo)致TreA的酸適應(yīng)性明顯高于ReATM1p。

酸性海藻糖酶在酵母中以一種單體形式發(fā)揮活性，在構(gòu)巢曲霉A.nidulans中以二聚體形式發(fā)揮酶活性。酸性海藻糖酶Km的范圍為0.8～5 mg·mL-1[19]，本研究中的酸性海藻酶TreA的Km為0.67 mg·mL-1，對海藻糖的底物特異性極強(qiáng)。酸性海藻糖酶另一特點(diǎn)是具有大量潛在的N-糖基化位點(diǎn)，這也解釋了TreA純化蛋白經(jīng)EndoH脫糖基處理后在SDS凝膠條帶變小的原因[19-23]。此外，分析酸性海藻糖酶TreA的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其N端1～18位的短肽為信號肽，這進(jìn)一步驗(yàn)證了酸性海藻糖酶可通過分泌途徑的靶向轉(zhuǎn)運(yùn)，解釋了這類蛋白定位于細(xì)胞表面的原因[21]。

綜上所述，本研究成功獲得了一個新穎的酸性海藻糖酶基因TreA，并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。該酸性海藻糖酶具有良好的酸適應(yīng)性，同時對海藻糖有專一、較好的水解活力。這些特點(diǎn)表明酸性海藻糖酶TreA在生物工業(yè)中具有極大的應(yīng)用價值。