孫艷, 韓斌, 袁軍偉, 劉長江, 李敏敏, 尹勇剛,賈楠, 郭紫娟, 趙勝建

(河北省農林科學院昌黎果樹研究所, 河北 昌黎 066600)

葡萄(VitisviniferaL.)作為世界性的重要經濟水果，因其具有適應性強、產量高、經濟效益顯著等優(yōu)點，受到我國北方地區(qū)果農的廣泛青睞，成為我國農業(yè)產業(yè)化的重要組成部分。低溫凍害是影響北方地區(qū)葡萄產業(yè)發(fā)展的主要限制因素。近年來我國北方地區(qū)極端低溫頻發(fā)，使葡萄產業(yè)遭受巨大經濟損失。因此，葡萄抗寒性研究成為研究熱點，特別是探索適宜、快速評價品種抗寒性的方法對于葡萄抗寒性研究具有重要意義。

前人對葡萄抗寒性的鑒定方法及抗寒生理指標進行了研究，由于相對電導率大小與葡萄抗寒能力呈負相關[1-2]，因此，相對電導率法是目前葡萄進行抗寒性鑒定較為可靠的方法之一。但電導率法預處理所需時間較長，對處理溫度及時間要求嚴格，且試材需求量大，因此不適用于大量種質的抗寒性篩選[3]。生長試驗法和組織褐變法也可用于鑒定葡萄抗寒性。李桂榮等[4]研究發(fā)現，隨著脅迫溫度的降低，6個葡萄品種扦插枝條的生根率均呈下降趨勢；鄭曉翠等[5]利用組織褐變法對14個葡萄砧木品種的抗寒性進行了分級。這兩種鑒定方法均存在檢測時間長的問題，且要求操作者有一定經驗積累[6]。除以上3種方法外，可溶性糖、脯氨酸、丙二醛和淀粉含量等指標也可用來鑒定葡萄抗寒性[7-9]。然而生理指標的測定過程更加繁瑣，且對環(huán)境條件要求較高[10]。Viands[11]和劉志鵬等[12]研究了苜蓿根部抗寒的形態(tài)機理，指出根系形態(tài)與抗寒性密切相關，分枝型苜蓿比直根型苜蓿具有更強的抗寒性，該方法直觀且操作簡便。然而，截至目前，關于葡萄根系形態(tài)和抗寒性關系的研究尚不多，關于葡萄根系質地硬度與抗寒性關系的研究也相對空白[13]。基于此，本研究以8個不同抗寒性葡萄品種為試驗材料，探討了葡萄休眠期的根系角度、解剖結構、含水量及質地硬度等指標與抗寒性的關系，以期篩選出操作簡單高效、結果可靠的抗寒指標，進而為葡萄抗寒性的鑒定、高抗寒品種的選育及抗寒栽培提供科學依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試葡萄品種包括高抗寒品種：左山一(VitisamurensisRupr.)和貝達(Vitisriparia×Vitislabrusca)，中抗寒品種：山河2號(Vitisamurensis×Vitisriparia)、5BB(Vitisberlandieri×Vitisriparia)、SO4(Vitisberlandieri×Vitisriparia)和1103P(Vitisberlandieri×Vitisrupestris)，低抗寒品種：玫瑰香(VitisviniferaL.)和紅地球(VitisviniferaL.)，不同組分間抗寒性差異顯著[14-15]。葡萄品種均來自于河北省農林科學院昌黎果樹研究所葡萄資源圃，栽培管理條件一致。以一年生扦插苗的成熟根系為試驗材料，試驗于2017年11月進行。

1.2 試驗設備

試驗設備包括CT3質構分析儀(美國Brookfield公司)、GDJS-500L高低溫交變試驗箱(江蘇無錫索亞特試驗設備有限公司)、雷磁DDS-11A型電導率儀(上海儀電科學股份有限公司)、切片機(江蘇常熟科學儀器廠)、KD-T電腦生物組織攤烤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、奧林巴斯BX51顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)、海爾BCD-137TMPA低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)和2WAJ阿貝折光儀(上海光學儀器五廠)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1相對電導率測定預處理：以一年生扦插苗根系為材料，將根剪下后用自來水沖洗以去除表面泥沙，剪去須根，選取粗度為2.0～3.0 mm的根段。用去離子水反復沖洗，晾干，剪成4.0～5.0 mm長的根段，放入10 mL離心管，加蓋，置于0 ℃冰箱保存。參照前人的研究結果[16-17]，以-9 ℃作為最佳冷凍處理溫度，采用高低溫交變試驗箱進行低溫處理。處理過程如下：以4 ℃·h-1的降溫速度將溫度降至預設溫度，在預定溫度下保持4 h，以4 ℃·h-1的速度升至4 ℃，然后于4 ℃的冷藏冰箱中備用。

將根段切成2.0～3.0 mm 長的小段。稱取1.00 g根段置于30 mL帶刻度試管，加入25 mL去離子水，加蓋，置于20～23 ℃下保溫24 h。保溫期間用手震蕩1～2次。用電導率儀測定浸出液電導率(C1)，然后煮沸20 min殺死組織，靜置3～4 h至室溫測定電導率(C2)，計算相對電導率(relative conductance，REC)。每個品種重復3次。

REC=C1/C2×100%

1.3.2根系角度的測量將葡萄根系挖出，統(tǒng)計骨干根(2.0 mm<直徑<5.0 mm)總數。用量角器測量骨干根角度，以根系與主干延伸方向形成的夾角來衡量根系類型[18],夾角小于40°為垂直根, 夾角大于 70°為水平根, 介于兩者之間為傾斜根，每個品種測量50棵植株。骨干根總數為垂直根、傾斜根和水平根三者之和。分枝角度(root angle，RA)為所有骨干根角度的平均值。垂直根、水平根和傾斜根的比例計算公式如下。

垂直根占比=垂直根條數/骨干根總數×100%

傾斜根占比=傾斜根條數/骨干根總數×100%

水平根占比=水平根條數/骨干根總數×100%

1.3.3根系解剖結構的觀察將各品種葡萄根系洗凈去除須根后，選取粗度為2.0～3.0 mm的根段，剪成4.0～5.0 mm長。制作石蠟切片[19],步驟如下：固定-脫水-透明-浸蠟-包埋-修蠟塊和粘蠟塊-切片-展片與粘片-脫蠟-染色-封片。最后，將晾干后的載玻片置于顯微鏡下觀察、照相，并對射線細胞大小(size of ray cells，SRC)、導管直徑(vessel diameter，VDR)和導管密度(vessel density，VDY)等指標進行測量。射線細胞大小為25個細胞的平均值，導管直徑為20個導管的平均值，數據均在40 倍鏡下觀察測得，皮層比率(ratio of cortex thickness，RCT)在10倍鏡下觀察測得。每個品種隨機選擇5個根段進行處理。

1.3.4根系含水量的測定根系總含水量(total water content，TWC)、自由水含量(free water content,FWC)參照高俊鳳[20]的方法進行測定。束縛水含量(bound water content，BWC)及自束比(自由水含量與束縛水含量之比，F/B)計算公式如下。

BWC=TWC-FWC

F/B=FWC/BWC

1.3.5根系硬度及做功量的測定選取粗度為(2.5±0.2) mm成熟根段，洗凈將外表水分吸干，剪成長度(5.0±0.3) mm，放置于質構儀測試平板上，用刀片探頭TA-CKA對根段進行壓縮模式測試，橫切即刀片垂直于根系延伸方向，縱切即根系延伸方向垂直于測試平板。測試參數如下：觸發(fā)點負載5 g，測試速度0.7 mm·s-1，返回速度0.7 mm·s-1，數據頻率10 points·s-1，根系橫切目標值2.0 mm，縱切目標值1.0 mm，分別測定橫切及縱切過程中的根系硬度及做功量。根系硬度包括橫切硬度(cross cutting hardness，CCH)和縱切硬度(longitudinal cutting hardness，LCH)，做功量包括橫切總功(cross cutting total work，CCTW)和縱切總功(longitudinal cutting total work，LCTW)每個品種橫切和縱切分別選取20段根系進行測定。葡萄根系質地特征曲線見圖1。以圖1中的最高峰F表示硬度(g)，峰面積S表示做功量(mJ)。

1.4 數據統(tǒng)計

利用Microsoft Office Excel 2016軟件進行數據處理，并制圖；采用SPSS 17.0軟件對差異顯著性分析及Duncan 多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄品種根系相對電導率

圖2結果顯示，高抗寒品種左山一和貝達的根系相對電導率值較小，分別為41.49%和42.86%，均顯著低于其他品種；低抗寒品種玫瑰香和紅地球的根系相對電導率值較大，分別為72.9%和75.98%，顯著高于其他品種；中抗寒品種山河2號、5BB、SO4和1103P的根系相對電導率在45%～55%，顯著高于高抗寒品種，但低于低抗寒品種。

圖1 葡萄根系壓縮模式下質地特征曲線Fig.1 Texture characteristic curve in grapevine root under compression mode

2.2 不同葡萄品種根系角度

從表1可知，高抗寒品種(左山一和貝達)的分枝角度與低抗寒品種(玫瑰香和紅地球)間差異不顯著(P>0.05)。其中，低抗寒品種紅地球的垂直根占比較高，為50%；傾斜根占比較低，為38.89%。中抗寒品種5BB的垂直根占比較低(7.69%)，水平根占比較高(11.54%)；品種SO4的傾斜根占比較高(85.00%)；品種1103P的根系中未檢測到水平根。由此可見，不同葡萄品種的根系角度分布與抗寒性未呈現規(guī)律性。

2.3 不同葡萄品種根系解剖結構

葡萄根系解剖結構與其抗寒性有相關關系[21]。從表2結果可知，不同抗寒性葡萄品種的根系組織結構差異較大。高抗寒品種左山一的射線細胞大小、導管密度及導管直徑均最小；貝達的皮層比率最小。低抗寒品種(玫瑰香和紅地球)的射線細胞大小、皮層比率、導管密度及導管直徑均顯著高于高抗寒品種(左山一和貝達)。顯微觀察不同品種的根系解剖結構(圖3)，高抗寒品種(左山一和貝達)的射線細胞較小、數目較多，組織結構緊密，形成了清晰的髓射線，導管細且數目較少，且在木質部邊緣分布較少；而低抗寒品種(玫瑰香和紅地球)的射線細胞較大且數目較少，組織結構疏松，導管粗且數目較多，分布可達到木質部邊緣。由此表明，根系的內部結構特征與葡萄抗寒性密切相關。

注：不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。Note：Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.圖2 葡萄根系的相對電導率Fig.2 Relative conductivity of the grapevines roots

表1 葡萄根系的類型Table 1 Root types of the grapevines

表2 葡萄根系解剖結構特征Table 2 Anatomy characteristics of the grapevines roots

圖3 葡萄根系解剖結構Fig.3 Anatomical structure of the grapevines roots

2.4 不同葡萄品種根系含水量

從表3可知，不同抗寒性品種間的總含水量及自由水含量差異顯著。高抗寒品種(左山一和貝達)的自由水含量和自束比顯著低于其他品種，左山一的總含水量顯著低于其他品種。低抗寒品種(玫瑰香和紅地球)的總含水量、自由水含量和自束比均顯著高于其他品種。

2.5 不同葡萄品種根系硬度及做功量

根系硬度和做功量代表根系在外力的切割作用下抵抗斷裂的能力。不同品種根系的硬度和做功量均存在較大差異(表4)。其中，高抗寒品種左山一的根系橫切硬度、橫切總功、縱切硬度和縱切總功均最高，且后三項指標顯著高于其他品種；低抗寒品種紅地球的根系橫切硬度、橫切總功、縱切硬度和縱切總功均最低，且后兩項指標顯著低于其他品種。

2.6 葡萄根系生理指標相關性分析

對葡萄根系14個抗寒指標進行相關性分析，結果(表5)表明，根系電解質滲出率與除根系角度外的12個性狀均呈極顯著相關；射線細胞大小與橫切總功、橫切硬度、縱切總功和縱切硬度間均呈極顯著負相關；總含水量與橫切總功、橫切硬度、縱切總功和縱切硬度間均呈極顯著負相關。

表3 葡萄根系含水量Table 3 Water content of the grapevines roots

3 討論

3.1 葡萄根系相對電導率與抗寒性的關系

植物細胞電解質的外滲程度可用相對電導率來表示，反映植物細胞膜系統(tǒng)的低溫傷害程度[22]。相對電導率越大，表明植物組織細胞電解質透過細胞膜的通透性越大，即植物抗寒性越弱[23]。葡萄根系的相對電導率能夠真實反映不同品種的抗寒性差異[24]。本研究中，低溫脅迫下，左山一和貝達的抗寒性較強，其根系的相對電導率顯著低于其他品種；而紅地球和玫瑰香的抗寒性較弱，其根系的相對電導率顯著高于其他品種，這與高振等[15]研究結果一致。

3.2 葡萄根系角度與抗寒性的關系

植物根系分布影響著植物對逆境的抵抗能力[25]。目前，有關植物根系形態(tài)與抗寒性關系的研究主要集中于草本作物。劉志鵬等[12]研究指出，苜蓿根系形態(tài)與抗寒性密切相關，不同抗寒性品種的根系類型差異顯著，分枝型根系比直根系能更好地忍受凍害。孫波等[26]研究發(fā)現，高抗寒甘蔗品種根系的分枝角度小，呈向下生長趨勢；而低抗寒品種根系的分枝角度大，呈平周生長趨勢。本研究中8個葡萄品種的根系角度與抗寒性間未呈現相關性，低抗寒品種紅地球的垂直根占比為50%，高抗寒品種左山一的垂直根占比為13.64%。這與前人研究結果存在差異，可能與材料處理時期有關。葡萄根系的形態(tài)特征受到一系列對根原基進行負調節(jié)的基因型控制[27]，不同品種可能存在不同的抗寒基因,這些抗寒基因只有在特定時期、特定條件下被激活，從而誘發(fā)根系形成不同的形態(tài)結構以抵御逆境[28]，而這種適應性變化存在明顯的基因型差異[29]。本研究中葡萄根系由于低溫進入休眠，而不同品種根系對溫度變化的敏感程度不同，左山一和貝達根系感受到的低溫環(huán)境可能不足以誘發(fā)控制根系形態(tài)的抗寒基因表達，從而導致其垂直根比例較低。除此之外，根系形態(tài)建成也受地上部生長發(fā)育的影響。潘曉華等[30]研究指出，根冠的生長方向受地上部向根系輸送碳水化合物的影響，地上部光合強度高，則垂直根和傾斜根的比例增加，反之則水平根的比例增加。由于不同葡萄品種的地上部光合特性存在差異，造成本研究中中抗寒品種1103P和SO4垂直根和傾斜根的比例較大，水平根比例較??；而高抗寒品種左山一和貝達垂直根和傾斜根的比例較小，水平根比例較大。由此可見，不同抗寒性葡萄品種的根系形態(tài)建成機理仍需深入研究。

3.3 葡萄根系解剖結構與抗寒性的關系

葡萄根系內部結構的形成是對環(huán)境長期適應的結果，與品種抗寒性密切相關。本研究發(fā)現，高抗寒品種左山一和貝達的根系具有組織緊密、射線細胞小、皮層比例低、導管小且密度低的結構特點，與低抗寒品種紅地球和玫瑰香之間差異顯著。因此，根系解剖結構特征可作為葡萄品種抗寒性鑒定的指標之一。這與郭修武等[31]的研究結果相一致。射線細胞體積小、排列緊密，不僅有利于水分經較短距離遷出細胞、減少細胞內結冰[32]，還可以貯藏大量營養(yǎng)物質，增強對凍害的防御功能。木質部導管直徑小，則樹液結冰造成的木質部栓塞化程度低[33]，使得木質部能夠保持一定的水分疏導功能，從而減輕胞外結冰帶來的傷害，有助于葡萄植株在受凍后的解凍過程中快速恢復疏導能力[34]，從而恢復正常生理代謝。因此，導管直徑小這一結構特性對于植物抗寒尤為重要。

3.4 葡萄根系含水量與抗寒性的關系

植物組織內的水分主要以自由水和束縛水兩種狀態(tài)存在。自由水不與原生質體緊密結合，主要存在于細胞間隙，可以自由移動；束縛水則相反[35]，束縛水是細胞內親水性大分子物質強行結合的水,對維持原生質體膠體穩(wěn)定具有重要作用。葡萄根系含水量特別是自由水含量低，細胞液濃度高，生理代謝活動弱，有利于增強樹體抵御凍害的能力。本研究證實，不同抗寒性葡萄品種在同一休眠時期的根系含水量存在差異，高抗寒品種左山一和貝達表現為根系總含水量和自由水含量較低、自束比較小，與低抗寒品種玫瑰香和紅地球間差異顯著。Lyons[36]研究指出，凍害發(fā)生時，細胞間隙中的水首先結冰形成冰核，隨著低溫的延續(xù)，結冰范圍逐漸擴大，原生質內的水向細胞間隙滲透，造成細胞嚴重脫水，細胞膜皺縮，同時結冰又會對細胞膜產生擠壓，造成細胞膜機械損傷。冬季當氣溫降至0 ℃以下時，細胞間隙的自由水便開始結冰；而束縛水的冰點在-20～-25 ℃以下[37]，遠低于自由水。因此，當根系中束縛水含量較高、自由水含量較低時，結冰溫度相應降低，則抗寒性增強。相反，當自由水含量較高、束縛水含量較低時，葡萄根系生理代謝活動比較旺盛，則抗寒性較弱。陳佰鴻等[38]的研究也證明了根系的含水量與其抗寒性關系密切。

3.5 葡萄根系硬度與抗寒性的關系

質構儀作為一種新型的食品品質測試儀器，被用于測定經碳酸鈣真空浸漬后巨峰葡萄的果實硬度[39]。Gwanpua等[40]使用質構儀研究了貯藏期間喬納金蘋果果實硬度的變化。本研究使用質構儀測定葡萄不同抗寒性品種的根系硬度，結果表明，高抗寒品種左山一和貝達的根系硬度及做功量較大，而低抗寒品種玫瑰香和紅地球的根系硬度及做功量較小。同時相關分析表明，根系硬度及做功量與射線細胞大小呈極顯著負相關，即射線細胞越小，組織排列越緊密，則根系硬度及做功量越大；反之，則根系硬度及做功量越小。根系木質部細胞細胞壁較厚，為根系提供了主要的結構支撐。纖維素、半纖維素、木質素和果膠質作為細胞壁的主要組成成分，關系著植物細胞機械組織的發(fā)達程度[41]，進而影響著根系硬度。前人研究指出，細胞壁中纖維素、半纖維素及果膠質的含量變化與果實軟化密切相關[42]。細胞壁中較多的纖維素和木質素含量能夠增加種皮的機械強度和堅硬度[43]。牢固的纖維素結構使細胞壁具有高強度性能，木質素使細胞相連，增加細胞壁的抗壓強度，強化植物組織,半纖維素與纖維素微纖絲結合，而果膠質則分布在半纖維素和纖維素微絲中并與之緊密交聯，形成復雜的網絡結構，對細胞壁的結構起到加固作用[44]。本研究中，根系解剖結果表明，高抗寒品種左山一和貝達的射線細胞較小，排列緊密，纖維素和木質素等細胞壁組成物質相對含量增加[45]，因此硬度較低、抗寒性較強。且根系硬度及做功量與總含水量呈極顯著負相關，即總含水量越少，根系硬度及做功量越大；反之，則根系硬度及做功量越小。前人研究表明，冬季根系水分含量低，但根系的抗拉強度卻較夏季大[46]。郭凱力等[47]和蔣坤云等[48]的研究表明，根系含水量越高，細胞壁纖維韌性越低，遇到外力作用時抵抗斷裂的能力也越弱，與本研究結論相似。由此表明，根系的內部結構特征與抗寒性密切相關，是植物對環(huán)境長期適應的結果。因此，根系硬度及做功量可作為葡萄抗寒性鑒定的指標之一。

綜上所述，高抗寒葡萄品種具有低溫脅迫下相對電導率低、根系組織結構緊密、自由水含量低、自束比小、硬度及做功量大等特點，利用這些特點可以有效評價葡萄抗寒性。根系橫切總功與相對電導率間相關性較強，且測定方法簡單，對環(huán)境條件要求低，適宜作為快速、準確鑒定葡萄抗寒性的指標。