任麗芳，馬玉珍，何金英

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科；2.婦產(chǎn)科醫(yī)學生殖中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)指妊娠期間發(fā)生糖耐量異常，是妊娠期常見的并發(fā)癥之一[1]。隨著現(xiàn)代亞健康生活方式、肥胖人口增多以及孕婦平均生育年齡的上升，近年來GDM發(fā)病率逐漸上升。流行病學數(shù)據(jù)顯示2015年全球妊娠期血糖增高患者為16.2%，其中GDM患者高達85.0%[2]。妊娠期血糖增高若未經(jīng)及時有效治療可對孕婦生命健康、胎兒發(fā)育以及胎兒結(jié)局產(chǎn)生嚴重不良影響[3]。有研究發(fā)現(xiàn)孕婦胎盤組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporters，GLUT)、胰島素信號轉(zhuǎn)導蛋白(insulin receptor substrates，IRS)、性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)水平表達與GDM緊密相關，其對GDM的發(fā)病程度和預后情況都具有明顯判定價值[4]。因此，本研究主要通過對GDM孕婦胎盤組織中的GLUT、IRS、SHBG水平表達進行分析，探討這些指標表達水平及與GDM發(fā)病的關系。

1資料與方法

1.1研究對象

選取2017年12月至2018年12月期間在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科定期產(chǎn)檢并且行剖宮產(chǎn)的GDM孕婦42例作為研究組。納入標準：①符合GDM的診斷標準[5]，并經(jīng)臨床確診；②既往無糖尿病史或其他慢性病史；③妊娠37～42周，有剖宮產(chǎn)手術指征；④無其他妊娠期并發(fā)癥；⑤按時產(chǎn)檢且病歷資料完整。排除標準：①既往有糖尿病史或其他慢性病史；②有胎兒畸形、流產(chǎn)、死胎分娩史；③合并心、肺、肝、腎等重要器官功能損害者。另選取同一時期行剖宮產(chǎn)的健康孕婦42例作為對照組，對照組各項產(chǎn)檢指標正常，排除標準同研究組。所有研究對象由本院檢驗科檢測空腹血糖、口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)2h血糖、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、游離甲狀腺素4(free thyroxine 4，F(xiàn)T4)。本次研究已獲得所有研究對象知情同意，且經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2研究標本

當產(chǎn)婦分娩胎盤隨之娩出時迅速在臍帶附著處剪取3塊1cm3的絨毛組織，采用生理鹽水洗凈并作吸干處理，于凍存管中經(jīng)液氮速凍4h，再保存在-80℃條件下備用。

1.3研究試劑

qPCR檢測中所需要的RNA引物、Trizol試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時PCR試劑盒均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。Western blot檢測中所需要的鼠抗人GLUT-1單克隆抗體、兔抗人GLUT-3單克隆抗體、兔抗人GLUT-4單克隆抗體，兔抗人IRS-1單克隆抗體、兔抗人IRS-2單克隆抗體、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，P13K)p85α單克隆抗體，SHBG單克隆抗體均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.4研究方法

1.4.1 qPCR檢測

提取凍存已裂解的GDM胎盤組織和健康孕婦胎盤組織各100mg，采用Trizol試劑提取胎盤組織總RNA，測定濃度、純度合格后將RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再通過實時定量PCR儀(型號ABI 7300)擴增。反應體系30μL，反應條件：于95℃下持續(xù)10min，預變性，再于95℃下持續(xù)15s變性；60℃退火且延伸45s，一共進行40個循環(huán)。每組實驗重復3次，然后采用2(-△△CT)法對目的基因的相對表達量進行計算處理。

1.4.2 Western blot檢測

提取妊娠合并糖尿病胎盤組織和健康孕婦胎盤組織，加入蛋白裂解液并充分裂解(4℃條件下，12 000r/min，離心10min)，收集上清總蛋白，測定蛋白濃度、純度合格，分別取40μL上樣量進行電泳(SDS-PAGE凝膠)，轉(zhuǎn)印(75V、90min)，封閉(10%脫脂奶粉)1h，滴加鼠抗人GLUT-1單克隆抗體(1∶200)、兔抗人GLUT-3多克隆抗體(1∶200)、兔抗人GLUT-4單克隆抗體(1∶200)、兔抗人IRS-1單克隆抗體(1∶200)、IRS-2單克隆抗體(1∶200)、兔抗人PI3K-p85α單克隆抗體(1∶500)、兔抗人SHBG單克隆抗體(1∶200)，采用兔源性β-actin(1∶1 000)為內(nèi)參照，4℃孵育過夜。洗膜，分別與對應的二抗于室溫下孵育2h，并ECL顯色，采用自動凝膠成像分析儀(購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，SG2011)分析各條帶灰度值。所有檢測操作均有專人負責，且嚴格按照產(chǎn)品說明書進行。

1.5統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1兩組孕婦一般資料比較

研究組空腹血糖、OGTT 2h血糖、新生兒體重均顯著高于對照組(均P<0.05)，兩組其他一般資料相比差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 兩組孕婦一般資料比較

2.2兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG mRNA表達比較

與對照組相比，研究組孕婦胎盤組織中GLUT-3、GLUT-4、IRS-2、P13K-p85α、SHBG mRNA水平表達顯著降低(均P<0.05)，而研究組孕婦胎盤組織中IRS-1、GLUT-1 mRNA水平表達較對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表2。

表2 兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG mRNA表達比較

2.3兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG蛋白表達比較

與對照組相比，研究組孕婦胎盤組織中GLUT-3、GLUT-4、IRS-1、SHBG蛋白水平表達顯著降低(均P<0.05)，而研究組孕婦胎盤組織中P13K-p85α、IRS-2、GLUT-1蛋白水平表達較對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表3，兩組孕婦的蛋白電泳條見圖1。

表3 兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG蛋白表達比較

注：1～5正常對照組，6～10GDM組。

2.4兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG mRNA水平表達相關性分析

經(jīng)過Pearson分析結(jié)果顯示：SHBG與GLUT-3、GLUT-4、IRS-2、P13K-p85αmRNA水平表達呈顯著正相關性(r值分別為2.081、4.842、3.660、3.492，均P<0.05)；IRS-2與GLUT-1、GLUT-4 mRNA水平表達呈顯著正相關性(r值分別為4.033、2.841，均P<0.05)；IRS-1與GLUT-3、P13K-p85αmRNA水平表達呈顯著負相關性(r值分別為-5.124、-3.556，均P<0.05)。

2.5兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG蛋白水平表達相關性分析

經(jīng)過Pearson分析結(jié)果顯示：SHBG與GLUT-3、GLUT-4、IRS-2蛋白水平表達呈顯著正相關性(r值分別為4.337、2.734、4.625，均P<0.05)；IRS-2與GLUT-1、GLUT-4蛋白水平表達呈顯著正相關性(r值分別為4.851、4.508，均P<0.05)；IRS-1與GLUT-3蛋白水平表達呈顯著負相關性(r=-4.667，P<0.05)。

3討論

3.1妊娠糖尿病發(fā)病機制

探尋GDM的發(fā)病機制，進行早期診斷以及進行針對性的預防和治療對保護母嬰健康至關重要[6]。目前臨床研究普遍認為GDM發(fā)病機制主要與胰島素抵抗相關，而胰島素轉(zhuǎn)導通路的異常改變能夠直接引發(fā)胰島素抵抗。當體內(nèi)胰島素結(jié)合α亞基受體后，誘發(fā)β亞基絡氨酸殘基自身磷酸化，并使IRS-1、IRS-2絡氨酸殘基磷酸化，從而與下游效應分子調(diào)節(jié)單位P13K-p85α相結(jié)合，激活下游效應因子P13K調(diào)節(jié)GLUT，GLUT失調(diào)可影響機體糖代謝平衡，由此可見胰島素信號轉(zhuǎn)導途徑的任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生異常改變都可直接影響胰島素的生物效應[7]。

3.2胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG的作用

GLUT是一類葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族，作為載體蛋白轉(zhuǎn)運單糖來維持機體內(nèi)的葡萄糖穩(wěn)態(tài)，也是孕婦與胎兒之間葡萄糖轉(zhuǎn)運的載體蛋白，是胰島素信號轉(zhuǎn)導途徑的最終步驟。研究報道孕婦胎盤組織中主要存在GLUT-1、GLUT-3、GLUT-4[8]。其中GLUT-1的含量最多而且分布較廣，其負責轉(zhuǎn)運母體循環(huán)和胎盤之間的葡萄糖，是孕婦與胎兒之間葡萄糖轉(zhuǎn)運的最主要的分子。GLUT-3的含量較少且呈散在分布，負責將葡萄糖從胎盤血池轉(zhuǎn)運至臍靜脈。GLUT-4的含量雖然最少，但卻在胰島素信號轉(zhuǎn)導途徑中起著關鍵性作用，該分子負責胎盤絨毛中的葡萄糖代謝，而胰島素可促使其加快轉(zhuǎn)運速率，當GLUT-4表達降低則胰島素敏感性隨之下降，進而發(fā)生胰島素抵抗[9-10]。因此，胎盤中GLUT表達異常可能與葡萄糖轉(zhuǎn)運異常以及胰島素抵抗息息相關。此次研究結(jié)果也證實研究組孕婦胎盤組織中GLUT-3、GLUT-4 mRNA以及蛋白水平表達較對照組而言均顯著降低(P<0.05)，說明GDM與孕婦胎盤組織中GLUT的表達水平具有一定的相關性。

IRS在胰島素轉(zhuǎn)導通路中主要作用是作為胰島素受體和P13K-p85α相連接的遞質(zhì)，當IRS與胰島素受體結(jié)合能力下降時，胰島素受體信號轉(zhuǎn)導受到影響，從而引發(fā)胰島素抵抗。此次研究結(jié)果顯示，研究組孕婦胎盤組織中IRS-1蛋白較對照組而言顯著降低(P<0.05)，呈低表達。與王麗娜等[11]的研究結(jié)果相符，證實孕婦胎盤組織中IRS-1的含量與GDM具有明顯相關性。

SHBG是由肝臟產(chǎn)生的一種運輸性激素的載體蛋白，調(diào)控人體內(nèi)性激素水平，可隨著胰島素水平的上升而下降，與胰島素抵抗密切相關，在GDM孕婦血清中呈低表達，故而也可將其用來預測GDM的發(fā)生和進展[12]。而近年來研究發(fā)現(xiàn)GDM孕婦的胎盤組織中也有SHBG表達存在[13]。本次研究結(jié)果顯示，研究組孕婦胎盤組織中SHBG mRNA以及蛋白水平表達較對照組而言均有顯著降低(P<0.05)，提示GDM孕婦胎盤組織中SHBG水平表達明顯下調(diào)。

3.3胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG的相關性

本次研究Pearson分析結(jié)果顯示，SHBG與GLUT-3、GLUT-4、IRS-2、P13K-p85αmRNA水平表達呈顯著正相關性(P<0.05)，IRS-2與GLUT-1、GLUT-4 mRNA水平表達呈顯著正相關性(P<0.05)，IRS-1與GLUT-3、P13K-p85αmRNA水平表達呈顯著負相關性(P<0.05)。另外，SHBG與GLUT-3、GLUT-4、IRS-2蛋白水平表達呈顯著正相關性(P<0.05)，IRS-2與GLUT-1、GLUT-4蛋白水平表達呈顯著正相關性(P<0.05)，IRS-1與GLUT-3蛋白水平表達呈顯著負相關性(P<0.05)，以上結(jié)果提示GLUT-4 mRNA以及蛋白水平降低與胰島素抵抗的程度具有相關性，且IRS-2在胰島素信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮較大的作用。此次研究與以往研究結(jié)果相符[14]。

綜上所述，GDM患者的GLUT、IRS、SHBG mRNA及蛋白水平表達顯著降低，且三者之間具有相關性。