趙陽(yáng)春，江麗燕，胡鳳英，祝秀芝

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 杭州 310000；2.浙江省麗水市蓮都區(qū)人民醫(yī)院，浙江 麗水 323000)

卵巢儲(chǔ)備功能下降(Decreased ovarian reserve，DOR)是指人類(lèi)雌性卵巢器官產(chǎn)生成熟卵泡的能力下降或不足，導(dǎo)致其性激素水平低下和生育能力下降，是婦產(chǎn)臨床工作中的常見(jiàn)病[1]，主要表現(xiàn)為月經(jīng)過(guò)少或閉經(jīng)、不孕等，并多伴有潮熱多汗、焦慮等自主神經(jīng)癥狀，可發(fā)展為卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)。近年來(lái)隨著生活工作環(huán)境的變化、心理壓力增加，DOR發(fā)病率呈逐漸增加[2]，嚴(yán)重影響女性生育潛能及生活質(zhì)量。目前DOR病因尚未明確，激素替代治療是西醫(yī)常用手段，但對(duì)DOR/POF導(dǎo)致的不孕療效并不理想，且可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生、乳腺癌發(fā)病機(jī)率上升[3]。雷公藤多苷是由雷公藤根莖中提取制成，其已廣泛應(yīng)用于臨床治療，具有不可或缺的功效[4]。但長(zhǎng)期服用該藥可導(dǎo)致諸多不良反應(yīng)甚至是不可逆毒性損傷，對(duì)女性而言，可造成女性生殖系統(tǒng)藥源性損傷[5]。本研究實(shí)驗(yàn)觀察雷公藤多苷致DOR小鼠子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)發(fā)育及卵巢相關(guān)干細(xì)胞因子、縫隙連接蛋白的表達(dá)變化，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性SD小鼠20只，體重(18.00±4.00)g，購(gòu)于江蘇博深生物科技有限公司。

1.1.2藥物

雷公藤多苷片(規(guī)格：10mg/片 國(guó)藥準(zhǔn)字Z33020422 浙江得恩德制藥股份有限公司生產(chǎn))，采用純凈水溶化。

1.1.3 主要試劑

兔抗鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)(北京美科美生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；卵巢干細(xì)胞因子(Stem cell factor，SCF)、縫隙連接蛋白37(Connexin 37，Cx37)引物(英濰捷基貿(mào)易有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(山東光合農(nóng)業(yè)科技有限公司)。

1.1.4主要儀器

組織包埋中心(SAKURA公司)；CS-VI型攤片烤片機(jī)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；倒置熒光顯微鏡(上海辛卯科學(xué)儀器有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(芬蘭雷勃公司)；紫外透射儀(上海復(fù)享光學(xué)股份有限公司)；顯微圖像分析系統(tǒng)(北京啟航博達(dá)科技有限公司)；可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海分析儀器廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物造模

將購(gòu)入的小鼠進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，然后連續(xù)10天進(jìn)行陰道涂片并觀察，選擇動(dòng)情周期正常的20只雌性SD小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組及模型組。對(duì)照組10只小鼠給予以正常飲食，不進(jìn)行其他操作。模型組10只小鼠給予以雷公藤制劑灌胃造模，劑量為75 mg/kg，1次/日，連續(xù)進(jìn)行2周后，予以小鼠0.9%的NaCl，劑量為2 mL/kg，1次/日，連續(xù)進(jìn)行5周。末次給藥24小時(shí)后，將小鼠進(jìn)行麻醉取血并處死，備用。

1.3觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

①檢測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜指數(shù)：將小鼠頸椎脫臼處死，開(kāi)腹取出子宮，計(jì)算子宮指數(shù)，臟器指數(shù)%=臟器重量/體重×100%；②采用免疫組化法檢測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜VEGF及其血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2)、SCF、Cx-37平均光密度值，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。將子宮稱(chēng)重，去左側(cè)段置于生理鹽水中進(jìn)行沖洗，采用10%甲醛固定，進(jìn)行烤片，常規(guī)脫蠟脫水、抗原修復(fù)等步驟，滴加一抗、二抗孵育，行DBA顯色，最蘇木素復(fù)染、中性樹(shù)膠封片，置于顯微鏡下觀察；③取小鼠腹主動(dòng)脈血，離心取上清液冷凍保存。采用雙抗體夾心檢測(cè)法檢測(cè)小鼠黃體生成素(Luteinizing hormone，F(xiàn)SH)、促卵泡素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、雌二醇(Estradiol，E2)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1兩組小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)比較

對(duì)照組卵巢結(jié)構(gòu)完整原始卵巢形態(tài)豐富，各級(jí)卵泡結(jié)構(gòu)整齊，卵母細(xì)胞清晰可見(jiàn)，形態(tài)飽滿(mǎn)；顆粒細(xì)胞分布均勻，血管及黃體豐富，未見(jiàn)病理性纖維化增生及炎性浸潤(rùn)；見(jiàn)圖1(A)。模型組卵巢萎縮，各級(jí)卵泡數(shù)量減少，顆粒細(xì)胞排列紊亂，黃體較少，可見(jiàn)病理性纖維化增生及炎性浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1(B)。

圖1 兩組小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)比較(HE染色×100)

2.2兩組小鼠子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)發(fā)育情況比較

模型組小鼠子宮指數(shù)(0.21±0.03)較對(duì)照組(0.24±0.01)明顯降低(t=3.00，P=0.01)；模型組小鼠子宮內(nèi)膜VEGF和VEGFR2的表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.86，P<0.01；t=111.80，P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)發(fā)育情況的比較

2.3兩組小鼠SCF、Cx-37表達(dá)水平的比較

模型組小鼠SCF的表達(dá)水平(0.33±0.04)較對(duì)照組明顯升高(0.14±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.57，P<0.01)；模型組小鼠Cx-37表達(dá)水平(0.11±0.02)較對(duì)照組(0.36±0.02)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.95，P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 兩組小鼠SCF、Cx-37表達(dá)水平的比較

2.4兩組小鼠性激素水平的比較

模型組小鼠血液中FSH水平(31.14±2.07 IU/L)高于對(duì)照組(19.08±1.36 IU/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.40，P<0.01)；對(duì)照組小鼠血液中LH水平為20.28±1.36 ng/L，模型組LH水平為51.42±3.89 ng/L，兩組小鼠血液中LH水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.90，P<0.01)；模型組小鼠血液中E2水平(52.39±8.01 ng/L)明顯低于對(duì)照組(91.59±5.28 ng/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.92，P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 兩組小鼠性激素水平的比較

3討論

3.1 雷公藤多苷致DOR小鼠子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)發(fā)育的變化

卵泡在卵巢皮質(zhì)中生長(zhǎng)、發(fā)育并逐漸形成可育卵泡的能力，反映女性?xún)?nèi)分泌激素水平和生殖潛能[6]。DOR是指卵巢中可招募卵泡的數(shù)量驟減，生產(chǎn)卵子的能力不足且卵子質(zhì)量下降，嚴(yán)重影響女性的生殖能力。臨床上主要體現(xiàn)在月經(jīng)、生育變化以及不良生育狀態(tài)。如月經(jīng)流量低，甚至閉經(jīng)、不規(guī)則月經(jīng)、反復(fù)自然流產(chǎn)等，癥狀嚴(yán)重者可表現(xiàn)為潮熱、焦慮等圍絕經(jīng)期癥狀，影響患者的生活質(zhì)量。既往研究顯示DOR的發(fā)病率為1%～3%，在閉經(jīng)中占2%～10%，DOR不經(jīng)治療1～6年可發(fā)展為POF，進(jìn)一步損害女性的生殖健康[7]。DOR的的病因尚不明確，可能與年齡、自身免疫因素(包括細(xì)胞免疫、體液免疫等)、遺傳學(xué)因素(包括X染色體數(shù)目異常、常染色體異常和基因突變等)、酶缺陷(相關(guān)酶的缺乏和失活)、醫(yī)源性因素(包括放療、化療、手術(shù)、感染等)以及環(huán)境毒物因素等。目前臨床對(duì)DOR的西醫(yī)治療主要采用激素替代療法(Hormone Replacement Therapy，HRT)及對(duì)癥支持治療為主，以緩解卵巢功能降低所致的生殖激素低下?tīng)顟B(tài)。但既往臨床研究顯示長(zhǎng)期應(yīng)用性激素有一定副作用，特別是對(duì)雌激素依賴(lài)性腫瘤有一定風(fēng)險(xiǎn)，故其應(yīng)用受到一定限制，且療效具有不穩(wěn)定性[8]。既往臨床藥理學(xué)研究顯示，雷公藤制劑長(zhǎng)期服用不加以干預(yù)可導(dǎo)致月經(jīng)紊亂等副作用，對(duì)女性生殖系統(tǒng)的影響較大[9]。子宮內(nèi)膜形態(tài)是評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的指標(biāo)，受卵巢激素變化的調(diào)節(jié)，若其生長(zhǎng)發(fā)育不良可導(dǎo)致月經(jīng)稀少、不孕等癥狀。內(nèi)分泌嚴(yán)重失調(diào)、藥物影響、手術(shù)導(dǎo)致內(nèi)膜損傷、子宮畸形發(fā)育等均可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)發(fā)育不良。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組卵巢結(jié)構(gòu)完整原始卵巢形態(tài)豐富，各級(jí)卵泡結(jié)構(gòu)整齊，卵母細(xì)胞清晰可見(jiàn)，形態(tài)飽滿(mǎn)；顆粒細(xì)胞分布均勻，血管及黃體豐富，未見(jiàn)病理性纖維化增生及炎性浸潤(rùn)。模型組卵巢萎縮，各級(jí)卵泡數(shù)量減少，顆粒細(xì)胞排列紊亂，黃體較少，可見(jiàn)病理性纖維化增生及炎性浸潤(rùn)。雷公藤多苷可破壞卵巢結(jié)構(gòu)功能，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)發(fā)育不良。VEGF是一種具有調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育及卵巢血管生成等作用的細(xì)胞因子，是重要的血管形成因子和血管通透因子，是評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)狀況的重要生物學(xué)指標(biāo)[10]。血管生成的速度在正常情況下較慢，且在發(fā)育完成后可以保持較高的穩(wěn)定性。而女性生殖組織中的血管生成會(huì)定期更新。VEGF與其受體結(jié)合可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)發(fā)育，保持血管的通透性。本研究結(jié)果顯示：相較于對(duì)照組，模型組小鼠子宮內(nèi)膜指數(shù)、VEGF及VEGFR2水平均明顯降低。因此，雷公藤多苷可導(dǎo)致VEGF及VEGFR2水平降低，影響生殖組織血管生成。

3.2雷公藤多苷對(duì)DOR小鼠SCF、Cx-37表達(dá)的影響

女性生殖功能隨著自身的發(fā)育也逐漸成熟，性激素也周期性波動(dòng)并定期釋放，刺激促進(jìn)卵泡從初級(jí)卵泡發(fā)育到成熟卵泡。而卵泡發(fā)育不全是導(dǎo)致卵巢功能損傷的主要因素。SCF是一種粒細(xì)胞來(lái)源的生長(zhǎng)因子，其在顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞中均存在表達(dá)，且可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖與分化，是一種可調(diào)節(jié)卵巢生長(zhǎng)發(fā)育及功能生理平衡的旁分泌因子，其可與卵巢顆粒細(xì)胞相互作用，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。在病理?xiàng)l件下，其水平升高[11]。既往有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，卵巢顆粒細(xì)胞可產(chǎn)生SCF，雖機(jī)制仍不明確，且發(fā)現(xiàn)SCF維持一定水平后可以刺激調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡，兩者相輔相成，形成反饋系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)“體內(nèi)平衡”共同調(diào)節(jié)早期卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育。細(xì)胞縫隙連接是一種由連接蛋白組成的蛋白質(zhì)連接通道，其廣泛存在于生殖細(xì)胞之間，Cx37可連接卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞間的縫隙，若缺失可影響卵泡成熟過(guò)程[12]。本研究結(jié)果也顯示相較于對(duì)照組，模型組小鼠Cx-37表達(dá)水平明顯下降，SCF水平明顯上升。

3.3 雷公藤多苷對(duì)DOR小鼠性激素水平的影響

卵巢是重要的女性生殖器官，其主要功能可分為兩部分：卵排出和激素分泌。卵巢中儲(chǔ)備大量卵泡，而卵泡的發(fā)育和成熟必須經(jīng)歷原始卵泡，初級(jí)卵泡，次級(jí)卵泡和成熟卵泡四個(gè)階段。如果女性卵巢功能受損，卵泡衰減速度加劇，而成熟卵泡則下降。而功能良好的成熟卵泡對(duì)女性生殖至關(guān)重要。在臨床對(duì)DOR/POF患者的診治過(guò)程中，以FSH，LH，E2等性激素為卵巢功能評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中以E2為直接診斷指標(biāo)，以FSH和LH為間接指標(biāo)。FSH是性腺軸分泌的主要激素，在促進(jìn)卵泡成熟和雌二醇的產(chǎn)生過(guò)程中起著重要作用；其作用機(jī)理是通過(guò)結(jié)合受體偶聯(lián)的G蛋白來(lái)調(diào)節(jié)卵泡的形成過(guò)程。除了FSH，激素LH對(duì)于卵泡發(fā)育直至排卵期也至關(guān)重要。既往研究表明LH可以與FSH共同促進(jìn)卵泡成熟并對(duì)卵巢黃體產(chǎn)生起到協(xié)助作用；E2是POF的直接診斷指標(biāo)，在FSH的作用下由竇卵泡產(chǎn)生，其水平與卵泡的數(shù)量相互影響，且可以通過(guò)反饋的方式調(diào)節(jié)FSH的水平，使其處于正常的“穩(wěn)定狀態(tài)”[13]。本研究結(jié)果顯示：相較于對(duì)照組，模型組小鼠FSH、LH水平明顯升高，E2水平明顯下降，說(shuō)明雷公藤多苷導(dǎo)致卵巢功能?chē)?yán)重受損，激素水平紊亂。

綜上所述，雷公藤多苷可引起小鼠體內(nèi)Cx-37表達(dá)下降，SCF表達(dá)上升，導(dǎo)致小鼠卵巢儲(chǔ)備功能下降，抑制子宮內(nèi)膜血管生成。