王傳敏 孟忠吉 陳悅

十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)感染科，湖北十堰442000

慢性乙型肝炎（CHB）是影響我國(guó)全民健康的重大傳染性疾病。 目前，HBV DNA 病毒載量檢測(cè)是唯一被許可的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，用于監(jiān)測(cè)外周血循環(huán)病毒顆粒數(shù)量，從而反映了肝臟內(nèi)病毒產(chǎn)生的活動(dòng)性。 核苷（酸）類(lèi)似物（NAs）廣泛用于治療CHB， 通過(guò)抑制病毒的逆轉(zhuǎn)錄和DNA 合成發(fā)揮抗病毒作用，但其不能直接靶向作用于HBV 復(fù)制的模板——cccDNA，并且可能需要終生用藥以抑制cccDNA 的回補(bǔ)。

cccDNA 定量檢測(cè)雖然是臨床評(píng)價(jià)治療效果和預(yù)測(cè)停藥終點(diǎn)的重要指標(biāo)，但因需要肝組織穿刺活檢具有一定的局限性，因此無(wú)法在臨床普遍開(kāi)展。 血清HBV RNA 作為cccDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[1]，是反映其活性的理想血清學(xué)替代指標(biāo)，它在血液中的含量可作為反映HBV 轉(zhuǎn)錄活性和判斷藥物療效更直接、更可靠的指標(biāo)[2]。HBV 前基因組RNA （pgRNA） 可存在于成熟病毒顆粒的核衣殼內(nèi)，這種病毒顆粒被稱(chēng)為“HBV RNA病毒樣顆?！?，在血液中可以檢測(cè)到全長(zhǎng)或剪接的pgRNA。最近的研究表明，HBV pgRNA 作為一種反映肝內(nèi)HBV cccDNA 存在狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄水平的新型血清學(xué)標(biāo)志物， 在CHB治療進(jìn)展方面具有重要的臨床意義[3-4]。 因此，本綜述將總結(jié)血清中HBV pgRNA 的來(lái)源、組成、特征及其在乙型肝炎臨床管理中的意義。

一、血清HBV pgRNA 來(lái)源與組成

1.全長(zhǎng)HBV pgRNA 的來(lái)源與組成

pgRNA 是HBV 逆轉(zhuǎn)錄的模板，HBV 基因組的復(fù)制需要pgRNA 與DNA 聚合酶相互作用以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 逆轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)的病毒衣殼中。 pgRNA 與DNA 聚合酶結(jié)合后被包裝到由240 個(gè)核心蛋白組成的核衣殼中。 pgRNA 中的3 個(gè)RGAG 基序與磷酸化的衣殼蛋白的羧基端相互作用來(lái)促進(jìn)核衣殼組裝[5]。 末端蛋白、 間隔區(qū)和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)中含有與HBV pgRNA5' 端莖環(huán)結(jié)構(gòu)（Hε）相互作用、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和包裝相關(guān)的氨基酸[6]。pgRNA 5' 端的“帽子”結(jié)構(gòu)對(duì)于pgRNA 包裝也很重要，因?yàn)?' 端“帽子”和Hε 之間的距離決定了pgRNA可否被包裝[7]。

在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，DNA 聚合酶中的RNaseH 會(huì)水解RNA模板，但保留5' 端寡核苷酸，隨后殘存的RNA 寡核苷酸置換到直接重復(fù)序列2（DR2），以啟動(dòng)正鏈合成[8]。 因此，基于pgRNA 的HBV 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制是一個(gè)多步驟過(guò)程，包括DNA 聚合酶的結(jié)合、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)、包裝、DNA 合成和RNA 水解。該過(guò)程需要病毒內(nèi)部和病毒-宿主之間相互協(xié)調(diào)配合， 病毒或宿主因子上的任何錯(cuò)誤均可能影響pgRNA 的穩(wěn)定性和功能。

NAs 終止HBV DNA 延伸可以發(fā)生在核衣殼成熟的不同階段。 當(dāng)恩替卡韋、阿德福韋或替諾福韋等NAs 在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)或負(fù)鏈合成的早期終止DNA 延長(zhǎng)時(shí)，RNaseH 功能可能不會(huì)被激活，核衣殼中的pgRNA 可能會(huì)保留完整的poly（A）“尾巴”， 或者僅3' 端被略微縮短但仍保有相對(duì)較長(zhǎng)的RNA 鏈。雖然據(jù)報(bào)道只有包裹了完整的負(fù)鏈DNA 的核衣殼才能被表面蛋白包裝，但仍有證據(jù)表明血液中病毒樣顆粒內(nèi)可以檢測(cè)到全長(zhǎng)的pgRNA[1,3]。

2.剪接HBV pgRNA（sp-pgRNA）的來(lái)源與組成

最初，人們認(rèn)為在HBV 感染的細(xì)胞中HBV RNA 剪接并不常見(jiàn)，但研究發(fā)現(xiàn)，HBV pgRNA 確實(shí)具有多個(gè)剪接供體和受體位點(diǎn)， 并且在包括土撥鼠肝炎病毒和鴨HBV 在內(nèi)的嗜肝DNA 病毒感染的組織中很容易檢測(cè)到剪接產(chǎn)物[9]。 實(shí)際上，目前已經(jīng)從組織培養(yǎng)和CHB 患者中鑒定出18 個(gè)以上的sppgRNA[10]。

在轉(zhuǎn)錄HBV pgRNA 活躍的細(xì)胞中， sp-pgRNA 占總pgRNA 的10%～30%。pgRNA 的剪接活性受HBV 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件 （PRE） 的調(diào)控，PRE 的SLα 莖環(huán)區(qū)域被認(rèn)為對(duì)HBV RNA 剪接調(diào)控很重要。 另外，在pgRNA 的第2951 位和3163 位核苷酸之間還存有一個(gè)內(nèi)含子剪接沉默子（ISS），刪除ISS 顯著促進(jìn)了sp-pgRNA 的產(chǎn)生[11]。人們還發(fā)現(xiàn)與宿主剪接相關(guān)的因子如La 蛋白和PSF 能刺激HepG2 和Huh7 細(xì)胞中sp-pgRNA 的表達(dá)[12]。 據(jù)報(bào)道，當(dāng)核心蛋白存在于CHB患者的肝細(xì)胞核時(shí)，sp-pgRNA 與全長(zhǎng)pgRNA 的比例明顯增高[13]。sp-pgRNA 在HBV 生命周期、感染持續(xù)性和發(fā)病機(jī)制中起的作用仍有待闡明，尚未排除sp-pgRNA 調(diào)節(jié)HBV 復(fù)制的可能性。

大 多 數(shù)sp-pgRNA 保 持 完 整 的5' 端H ε 結(jié) 構(gòu)、X 蛋 白ORF 和直接重復(fù)序列， 可以被包裝到衣殼中。 剪接的HBV RNA 通常在包膜蛋白（LHBs 的PreS1，MHBs/SHBs 的PreS2/S） 和Pol 聚合酶的合成上有缺陷，但是HBc （衣殼蛋白） 和HBV X 蛋白ORF 可能很大程度上保持不變。因此，sp-pgRNA不可能自動(dòng)復(fù)制和分泌含剪切的HBV DNA （spHBV） 的顆粒。 spHBV 顆粒的產(chǎn)生需要在同一細(xì)胞中pgRNA 和亞基因組RNA 翻譯出的Pol 和包膜蛋白進(jìn)行反式補(bǔ)償。反式提供的聚合酶能有效地對(duì)sp-pgRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和負(fù)鏈合成。有趣的是，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，spHBV 顆粒中的DNA 結(jié)構(gòu)主要為雙線性形式，而不是疏松環(huán)狀DNA[14]。

二、 血清HBV pgRNA 的臨床意義

1.全長(zhǎng)HBV pgRNA 的臨床意義

在20 多年前就有報(bào)道在CHB 患者血液中檢測(cè)到HBV RNA，這些HBV RNA 來(lái)自吸附在外周血單核細(xì)胞上的HBV顆粒[15]。據(jù)估計(jì)，在CHB 患者體內(nèi)，外周血單核細(xì)胞攜帶的病毒顆粒量大約是血清中病毒載量的0.5%，通過(guò)蔗糖密度梯度離心和抗體沉淀，發(fā)現(xiàn)血清中的pgRNA 包含在HBV 病毒樣顆粒中[16]。最近發(fā)現(xiàn)CHB 患者血清中病毒樣顆粒只能檢測(cè)到微量的pgRNA，pgRNA 主要來(lái)自于裸露的核衣殼[1-2]。 因此，血清HBV RNA 的來(lái)源值得進(jìn)一步研究。

當(dāng)NAs 阻斷病毒的逆轉(zhuǎn)錄和rcDNA 的合成時(shí)， 會(huì)導(dǎo)致血循環(huán)中病毒DNA 相對(duì)快速減少， 但不會(huì)導(dǎo)致包裝的pgRNA 迅速減少。 作用于病毒DNA 合成之前的藥物如核衣殼抑制劑可降低循環(huán)pgRNA 的水平。 因此， 血清HBVpgRNA 水平的檢測(cè)對(duì)HBV 感染的輔助診斷和NAs 的抗病毒療效監(jiān)測(cè)及停藥預(yù)測(cè)有著重要意義[17]。 越來(lái)越多的證據(jù)表明，血清pgRNA 的定量有助于確定CHB 患者終止NAs 治療是否安全。 研究發(fā)現(xiàn)，NAs 治療12 周時(shí)HBV RNA 水平與停藥后24 周內(nèi)HBV DNA 反彈率顯著相關(guān)，12 周時(shí)血清HBV RNA 水平可作為一獨(dú)立影響因素來(lái)預(yù)測(cè)初始的病毒學(xué)應(yīng)答;NAs 治療結(jié)束時(shí)如果pgRNA 仍能檢測(cè)到，停藥后24 周則很可能發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)。 HBV pgRNA 的狀態(tài)可以反映CHB 患者接受NAs 抗病毒治療的長(zhǎng)期預(yù)后，CHB 患者接受抗病毒治療48 周后HBV pgRNA 仍為陽(yáng)性的患者HBeAg 轉(zhuǎn)陰失敗的概率更高， 這些患者也需要更長(zhǎng)的時(shí)間實(shí)現(xiàn)HBeAg 轉(zhuǎn)陰及HBV DNA 轉(zhuǎn)陰[18]。 另外，在一項(xiàng)考察559 例HBeAg 陽(yáng)性的CHB 患者NAs 治療效果的研究中， 130 例患者經(jīng)2年NAs 治療后血清HBV DNA＜20 IU/mL，且HBeAg 轉(zhuǎn)陰。停藥后4年內(nèi)，46.5%的患者HBV DNA 反彈至＞2000 IU/mL。但如果停藥時(shí)患者血清HBV RNA 是陰性， 只有21.2%患者有病毒學(xué)指標(biāo)的反彈[19]。 因此，檢測(cè)血清中HBV RNA 水平可作為預(yù)測(cè)NAs 安全停藥的指標(biāo)[5，20-21]。 pgRNA 的定量也可以用于監(jiān)測(cè)NAs 耐藥突變的出現(xiàn)[22]。當(dāng)NAs 與IFN-α 一起使用時(shí)，HBV RNA 在治療早期的明顯下降預(yù)示NAs 和IFN-α 聯(lián)合治療的反應(yīng)較好， 而血清中病毒DNA 的水平無(wú)法揭示患者 是 否 會(huì) 對(duì) 治 療 產(chǎn) 生 應(yīng) 答[16]。 van B?mmel 等[23]應(yīng) 用NAs 和IFN-α 抗病毒治療3 個(gè)月后HBV RNA 降低則HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)化率更高， 而高水平HBV RNA 患者停止抗病毒治療易發(fā)生病毒反彈。

通過(guò)隨訪接受恩替卡韋治療的患者，Wang 等[4]觀察到循環(huán)中的HBV RNA 在表達(dá)水平和序列變異方面反映了肝臟中病毒RNA 的狀態(tài)：他們對(duì)血清中的HBV RNA，以及配對(duì)的肝臟中病毒RNA 進(jìn)行了深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA 在遺傳學(xué)上與肝內(nèi)HBV RNA 同源， 血清HBV RNA 水平反映了肝內(nèi)HBV RNA 的量以及亞型的組成。 此外， 還發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA 與肝組織學(xué)改變有關(guān)， 血清HBV RNA 水平以2.45 lg 拷貝/mL 為臨界值將肝組織輕度炎癥纖維化（Metavir評(píng)分＜2）與重度肝組織病理學(xué)區(qū)分開(kāi)。 然而，接受恩替卡韋治療的CHB 患者和HBV 感染的人源化小鼠， 血清病毒RNA和cccDNA 之間的定量相關(guān)性無(wú)法建立， 這表明血清HBV RNA 的水平只反映肝臟中cccDNA 的轉(zhuǎn)錄概況。

2.sp-pgRNA 的臨床意義

血清中spHBV 顆粒的剪接模式根據(jù)HBV 基因型和疾病分期而有所不同[10，24]。 在由急性感染發(fā)展為慢性感染的6例乙型肝炎患者均檢測(cè)到spHBV，但在完全康復(fù)的患者中只有9%被檢測(cè)到[25]。 在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)剪接供體和受體位點(diǎn)突變阻遏spHBV 產(chǎn)生， 可重新建立HBV 對(duì)IFN-ɑ 的敏感性，在乙型肝炎患者血液中spHBV 含量與對(duì)IFN-ɑ 治療的反應(yīng)性成反比[10]。 此外，對(duì)無(wú)癥狀攜帶者、慢性肝炎和肝硬化患者血清中病毒DNA 的測(cè)序分析表明，Pre-S1 第57～119位氨基酸之間的缺失在肝硬化患者更常見(jiàn)[26]。Redelsperger 等[27]評(píng)估了56 例CHB 患者和273 例急性乙型肝炎患者的spHBV DNA 水平與疾病狀況之間的關(guān)系， 結(jié)果顯示在肝壞死和纖維化的患者中，spHBV 相對(duì)于全長(zhǎng)HBV 的比例變得更高。 這些結(jié)果表明，肝細(xì)胞在病毒復(fù)制和免疫反應(yīng)所致的異常生理環(huán)境中可能傾向產(chǎn)生剪接的RNA。 此外，從多個(gè)原發(fā)性肝癌組織中分離到的剪接pgRNA 也顯示spHBV DNA可能是病毒基因組整合的來(lái)源[28]。 與CHB 患者相比，原發(fā)性肝癌患者spHBV 顆粒的含量更高[29]，它可能作為肝癌發(fā)生的標(biāo)志物[30]。

三、結(jié)語(yǔ)

目前研究顯示， 血清中的HBV pgRNA 既可以來(lái)自病毒顆粒又可以來(lái)自裸露的核衣殼；在未接受過(guò)NAs 治療的患者中，HBV RNA 水平低于HBV DNA；但在NAs 治療期間，病毒DNA 與RNA 的比例可以顛倒。 血清中HBV pgRNA 的表達(dá)水平和序列特征可以反映肝臟中cccDNA 的轉(zhuǎn)錄活性、表明耐藥突變體的出現(xiàn)并預(yù)測(cè)治療結(jié)果。 接受NAs 治療的患者，血清剪接pgRNA 相對(duì)于spHBV DNA 的比例會(huì)增加，而pgRNA 與病毒DNA 的比例也會(huì)增加。 另外， 從血清HBV RNA 深度測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)可能比HBcrAg 定量檢測(cè)更敏感，更能反映cccDNA 轉(zhuǎn)錄活性的動(dòng)態(tài)變化。 因此， 在乙型肝炎的臨床管理中， 對(duì)血清HBV RNA 進(jìn)行測(cè)定可用于預(yù)測(cè)抗病毒療效及預(yù)后判斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突