劉娟，趙歡蕊，付咪咪，段義忠

(榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000)

百里香又名麝草香，屬雙子葉唇形科芳香植物，是一種株型奇特矮小的亞灌木，花冠紫紅,色澤艷麗，于盛花期間散發(fā)特有的麝香香味，香味獨(dú)特,回味悠長(zhǎng)，因其特有的芳香氣味，自古以來(lái)作為一味重要的調(diào)味品被廣泛應(yīng)用于食物烹調(diào)，在西方國(guó)家尤為流行[1]。作為一種中西方應(yīng)用歷史已久的香料植物，干燥的百里香粉或葉片可用于制作調(diào)味香料，被加入到牛羊肉等肉類(lèi)的制作中用以除膻、提香，使肉湯湯鮮味美，食之令人食欲大增，因此深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[2-5]。除了具有濃郁的芳香氣味外，百里香還具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗衰老、美容養(yǎng)顏等功效，其中揮發(fā)性化合物被認(rèn)為是其發(fā)揮生理功效的關(guān)鍵物質(zhì)，其主要提取物百里香酚、香荊芥酚具有較強(qiáng)的殺菌、防腐及抗氧化等活性，被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、藥品等行業(yè)[6-9]。

氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)聯(lián)用技術(shù)是利用氣相離子的電場(chǎng)遷移速率差異進(jìn)而對(duì)離子進(jìn)行分析鑒定，集合了氣相色譜高分離度和離子遷移譜高分辨、高靈敏等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于揮發(fā)性有機(jī)化合物的痕量檢測(cè)[10]。與傳統(tǒng)的氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)相比，GC-IMS技術(shù)對(duì)樣品處理及分析的溫度更低，更利于熱穩(wěn)定性較差的揮發(fā)性化合物的檢出，其次，氣相離子在經(jīng)過(guò)氣相色譜的初步分離后，在離子遷移譜中實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的分離，其分離能力較普通色譜更強(qiáng)，此外，還具有儀器體積小便于攜帶、常壓工作后期維護(hù)成本低等多重優(yōu)勢(shì)，因此，氣相離子遷移譜技術(shù)在食品揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)、食品質(zhì)量把控等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

百里香揮發(fā)性成分含量低、組成復(fù)雜、易揮發(fā)、不穩(wěn)定，現(xiàn)有的分離與檢測(cè)技術(shù)還存在著各種各樣的限制，而利用GC-IMS技術(shù)對(duì)百里香揮發(fā)性成分分析的研究鮮有報(bào)道，因此，本研究選取GC-IMS聯(lián)用技術(shù)對(duì)百里香中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析研究，旨在為百里香資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，也為快速、高效分析百里香揮發(fā)性化合物拓寬了思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百里香：于2019年5～9月間取自陜西榆林臥云山地區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品：麝香草酚(thymol)純度>99%，批號(hào)100508-200301，中國(guó)藥品生物制品檢定所；香荊芥酚(carvacrol)純度>98%，批號(hào)2078896，上海瑞楚生物科技有限公司；無(wú)水乙醇(色譜純)：天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；水為超純水。

CTC Combi-PAL自動(dòng)頂空進(jìn)樣器 丹麥Densensor公司；Flavour Spec氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀：配有Laboratory Analytical Viewer (LAV)分析軟件及GC-IMS Library Search定性軟件(內(nèi)置NIST 2014保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)和G.A.S.漂移時(shí)間數(shù)據(jù)庫(kù)) 德國(guó) G.A.S公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 百里香樣品的制備

將采摘的百里香全草，去除根、莖稈后，人工將百里香花、葉進(jìn)行分離，陰干備用。百里香花期較短，根據(jù)采摘時(shí)間的不同將樣品分為F1采收期(5月20日采摘)和F2采收期(6月20日采摘)，樣品編號(hào)為F1和F2。百里香葉片則根據(jù)采摘時(shí)間的不同分為L(zhǎng)1采收期(5月20日采摘)、L2采收期(6月20日采摘)、L3采收期(7月22日采摘)、L4采收期(8月23日采摘)，樣品編號(hào)分別為L(zhǎng)1、L2、L3和L4。

1.2.2 頂空萃取條件

頂空進(jìn)樣體積：100 μL；孵育時(shí)間：15 min；孵育溫度：40 ℃；進(jìn)樣針溫度：45 ℃；孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min。

1.2.3 GC-IMS技術(shù)分析條件

色譜柱類(lèi)型：FS-SE-54-CB-1(15 m, ID:0.53 mm)，色譜柱柱溫60 ℃，載氣/漂移氣：高純氮?dú)?純度≥99.999%)，載氣流速：E1(漂移氣流速)為150 mL/min，E2(氣相載氣流速)為初始2 mL/min，2 min內(nèi)保持不變，2 min后增至100 mL/min，保持100 mL/min直至分析結(jié)束。IMS內(nèi)置放射源：β射線(氚，3H)；漂移電壓：5 kV，漂移管長(zhǎng)度：98 mm，管內(nèi)線性電壓500 V/cm，漂移管溫度45 ℃，漂移氣：高純氮?dú)?純度≥99.999%)，漂移氣流速150 mL/min，離子化模式：正離子。GC-IMS檢測(cè)分析時(shí)間：40 min。

1.2.4 GC-IMS技術(shù)檢測(cè)方法

每份樣品0.5 g，分別做3次平行試驗(yàn)，置于20 mL頂空瓶中，使用加熱的進(jìn)樣針抽取瓶?jī)?nèi)的頂空組分，通過(guò)Flavour Spec氣相色譜-離子遷移譜儀進(jìn)行分析。

1.2.5 GC-IMS技術(shù)定性定量分析

1.2.5.1 定性分析

通過(guò)儀器內(nèi)置NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析。利用Matlab R2014a進(jìn)行主成分分析(principal component analysis， PCA)。揮發(fā)性物質(zhì)的氣相色譜-離子遷移圖譜和指紋圖譜采用Reporter和Gallery插件程序繪制，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用LAV分析軟件繪制，表格采用Excel制作。

1.2.5.2 定量分析

通過(guò)G.A.S公司開(kāi)發(fā)的LAV分析軟件進(jìn)行百里香樣品的定量分析。采用外標(biāo)法對(duì)被分析物質(zhì)繪制Boltzmann函數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)分析物標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品濃度反推該分析物在百里香樣品中的濃度，完成定量。定量方法：分別稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品于棕色容量瓶中，配制1000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃保存。分別稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以70%乙醇水溶液(V/V)定容，配制濃度分別為0.54，5.37，10.75，21.50，42.99，85.99 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃保存，通過(guò)氣相色譜-離子遷移譜儀測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的離子峰強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 百里香揮發(fā)性成分定性分析

對(duì)百里香花、葉進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)定性分析，共檢測(cè)出72種揮發(fā)性物質(zhì)，以?xún)x器內(nèi)置的NIST氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)與IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫(kù)資料共定性識(shí)別出36種揮發(fā)性成分，包括醇類(lèi)8種、醛類(lèi)6種、酮類(lèi)6種、萜類(lèi)及其衍生物6種、酯類(lèi)5種、酸類(lèi)3種和雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)2種，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 百里香樣品揮發(fā)性成分的定性Table 1 The characterization of volatile components in Thymus vulgaris samples

2.2 百里香樣品的氣相色譜-離子遷移指紋圖譜

為了更直觀地表現(xiàn)百里香花、葉在不同采收時(shí)期揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)及濃度差異的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)所有樣品揮發(fā)性成分中已定性組分繪制氣相色譜-離子遷移指紋圖譜，見(jiàn)圖1。可以看出每種樣品的完整揮發(fā)性有機(jī)物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物的差異。圖中每一行代表一個(gè)樣品中選取的全部信號(hào)峰(每個(gè)樣品3次平行)，圖中每一列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在不同樣品中的信號(hào)峰。其中，顏色代表物質(zhì)的濃度，顏色越深表示濃度越大。

圖1 百里香已定性揮發(fā)性成分的氣相色譜-離子遷移指紋圖譜Fig.1 The GC-IMS of volatile components identified in Thymus vulgaris

對(duì)比全部樣品的指紋圖譜，由圖1可知，不同采收期百里香花朵、葉揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)基本相似，但一些揮發(fā)性物質(zhì)的濃度差異明顯，且呈現(xiàn)一定變化規(guī)律。葉中的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)及濃度要普遍高于花朵中，而不同采收期的花朵之間以及葉之間的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)及濃度也存在較大差異。圖1中A區(qū)域所示的揮發(fā)性物質(zhì)為百里香花朵、葉中普遍存在的物質(zhì)，在不同的花朵及葉樣品中的濃度較為相近，沒(méi)有明顯的分布特征，主要是一些醇類(lèi)、醛類(lèi)以及少量酯類(lèi)物質(zhì)。而圖中B區(qū)域所示的揮發(fā)性物質(zhì)則主要在百里香葉中分布，且其在葉樣品中的濃度普遍高于花朵中，比較典型的是一些萜類(lèi)及其衍生物，如檸檬烯、芳樟醇、α-松油醇、γ-松油烯等。圖中C區(qū)域所示的揮發(fā)性物質(zhì)則主要分布在百里香花朵中，其在花朵樣品中的濃度普遍高于葉中，主要涉及一些酮類(lèi)物質(zhì)，如環(huán)己酮、庚酮等。而2,3-丁二醇(已定性物質(zhì)第4列)，見(jiàn)圖中虛線框，在百里香花朵、葉中雖均檢出，但其在F2(6月)采收花中的濃度明顯高于F1(5月)采收的花朵，考慮這些揮發(fā)性物質(zhì)可以作為區(qū)分百里香不同器官及相同器官不同采收期的特征物質(zhì)。

2.3 百里香揮發(fā)性成分PCA分析

選取百里香全部樣品中所有揮發(fā)性化合物的信號(hào)峰進(jìn)行 PCA 分析，以檢測(cè)樣品間揮發(fā)性物質(zhì)是否有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)圖 2。其中，PC1的貢獻(xiàn)率為48%，PC2的貢獻(xiàn)率為24%，二者累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)72%，這說(shuō)明通過(guò)主成分分析能夠獲取表征樣品揮發(fā)性成分中的大部分信息。

圖2 全部樣品的PCA分析Fig.2 Principal component analysis of all samples

由圖2可以直觀看出樣品之間的特征差異，百里香花朵樣品和葉樣品之間的距離較遠(yuǎn)，而花朵或者葉子樣品彼此之間的距離相對(duì)近一些，但是仍然可以明顯區(qū)分，這是因?yàn)榛ǘ浜腿~的特征差異比較明顯，且單個(gè)樣品的重復(fù)性較好，可見(jiàn)，使用PCA分析可以準(zhǔn)確區(qū)分百里香花朵和葉，也能夠區(qū)分不同采收期的花朵和葉，這與指紋圖譜的分析結(jié)果一致，這間接說(shuō)明氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)在百里香摻假、質(zhì)量鑒別等方面具有很好的應(yīng)用潛力。

2.4 百里香揮發(fā)性成分定量分析

氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)除了可以對(duì)百里香樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析、差異鑒別以外，還可以利用LAV分析軟件對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。已有研究表明，百里香酚和香荊芥酚是百里香揮發(fā)油中的主要成分[11]，《歐洲藥典》中對(duì)百里香的同屬植物中二者的含量有明確規(guī)定，要求二者在揮發(fā)油中的總和要高于40%，我國(guó)百里香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中還沒(méi)有對(duì)二者含量的具體要求，一些研究學(xué)者已建立了關(guān)于二者含量檢測(cè)的方法以完善百里香的質(zhì)量把控[12]。然而，基于GC-IMS對(duì)二者的定量分析鮮有報(bào)道，因此，本研究采用GS-IMS技術(shù)對(duì)百里香中的百里香酚和香荊芥酚進(jìn)行定量分析，以期為百里香的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供一定數(shù)據(jù)支撐。

百里香酚和香荊芥酚二者為同分異構(gòu)體，由于分子結(jié)構(gòu)原因很難形成多聚體，此外，由于儀器的分離條件如分離柱類(lèi)型、溫度等因素所限，導(dǎo)致二者的峰重疊，無(wú)法分離，計(jì)算時(shí)只能通過(guò)二者的總峰強(qiáng)度計(jì)算二者總濃度。百里香酚GC-IMS標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3，回歸方程及檢出濃度范圍見(jiàn)表2。

圖3 百里香酚GC-IMS標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 GC-IMS standard curve of thymol

表2 百里香酚的回歸方程及檢出濃度范圍Table 2 The regression equations and detected concentration ranges of thymol

百里香樣品中百里香酚的GC-IMS檢出濃度見(jiàn)表3。

表3 樣品中百里香酚的GC-IMS檢出濃度Table 3 The concentration of thymol detected in Thymus vulgaris samples by GC-IMS

試驗(yàn)結(jié)果表明，百里香酚在百里香葉中的含量普遍高于其在花朵中的含量。在百里香花朵的發(fā)育過(guò)程中百里香酚的含量變化相對(duì)較小，盛花期花朵(F2)中百里香酚的含量略高于初花期的花朵(F1)，而在百里香葉的生長(zhǎng)過(guò)程中百里香酚的含量變化較為明顯，其中，5月份采摘的百里香葉(L1)中百里香酚含量最高，8月份采摘的百里香葉(L4)中百里香酚的含量最低。

裴香萍等[13]對(duì)山西榆社地區(qū)的百里香進(jìn)行百里香酚含量檢測(cè)，得出榆社地區(qū)6月份百里香中百里香酚的含量最高，本試驗(yàn)結(jié)論與之相似，推測(cè)可能是地域相近的原因所致。百里香花朵期較短，植株生長(zhǎng)發(fā)育較快，本試驗(yàn)基于GC-IMS技術(shù)對(duì)百里香的主要揮發(fā)性成分進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步深入探究了百里香不同采收期揮發(fā)性成分百里香酚的量變規(guī)律，為百里香原材料適采期的確定提供了數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)，即對(duì)于陜西榆林地區(qū)百里香中百里香酚的利用，應(yīng)以百里香葉為主，且最適采收期應(yīng)為百里香的生長(zhǎng)前期，即每年的5月份左右。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用GC-IMS技術(shù)對(duì)百里香花、葉中的揮發(fā)性有機(jī)物分別進(jìn)行定性分析、差異鑒別及定量檢測(cè)。從百里香花、葉中共檢測(cè)出72種揮發(fā)性物質(zhì)，定性識(shí)別出36種揮發(fā)性成分，宋述芹等[14]利用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分別從百里香花朵和葉中鑒定出24種和14種揮發(fā)性成分，可見(jiàn)采用GC-IMS技術(shù)對(duì)百里香揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)的分析更為適宜。通過(guò)GC-IMS技術(shù)建立不同采收期百里香花、葉中揮發(fā)性有機(jī)物的指紋信息模型庫(kù)，為百里香加工原料適采期的確定提供了數(shù)據(jù)支撐及科學(xué)依據(jù)，也為快速、高效分析百里香中的揮發(fā)性化合物提供了一種新的可靠手段。