鄧仕彬，方舒娜，崔和平，張曉鳴*

(1.莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，枇杷種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

美拉德反應(yīng)是一種自然界中廣泛發(fā)生的非酶褐變反應(yīng)，其產(chǎn)物常用來制作食用香精，在食品風(fēng)味、抑菌、抗氧化性等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。美拉德反應(yīng)初級(jí)反應(yīng)階段的主要產(chǎn)物是Amadori或Heyns重排產(chǎn)物，也稱為美拉德反應(yīng)中間體[4]，其在常溫下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，但是在加熱條件下很容易裂解產(chǎn)生呋喃類、醛類、吡嗪類化合物等重要風(fēng)味物質(zhì)[5]。范麗等[6]利用木糖-L-半胱氨酸的美拉德反應(yīng)中間體為基液成功制備得到了色、香、味俱佳的紅燒調(diào)味汁。因此，美拉德反應(yīng)中間體作為美拉德反應(yīng)中非常重要的風(fēng)味前體物，具備制備風(fēng)味調(diào)味料應(yīng)用于食品中的優(yōu)勢(shì)。

目前關(guān)于美拉德反應(yīng)中間體的制備方法已有一些報(bào)道，大多都是在無水甲醇等有機(jī)溶劑中合成，然而這些制備方法成本較高且污染嚴(yán)重，不適合在食品中應(yīng)用[7]。工業(yè)化常用的美拉德反應(yīng)中間體制備通常在水相中進(jìn)行。雖然Cui等[8]、Xu等[9]的研究均實(shí)現(xiàn)了美拉德反應(yīng)中間體的水相制備，但這些方法中的還原糖均以木糖為原料，作為一種反應(yīng)活性較高的五碳糖，其反應(yīng)速率明顯高于六碳糖。針對(duì)六碳糖的美拉德反應(yīng)中間體的水相高效制備還有待進(jìn)一步的研究。

本研究以葡萄糖和苯丙氨酸為原料，探索該體系中間體1-L-苯丙氨酸-1-脫氧-D-果糖(PDF)的水相制備方法，并對(duì)比常壓不脫水水相制備、微波加熱水相制備和真空脫水水相制備等方法的差異，以期實(shí)現(xiàn)PDF的水相制備，確定出最優(yōu)的制備方法和參數(shù)，并進(jìn)一步開發(fā)其在食品調(diào)味中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

D-葡萄糖、L-苯丙氨酸、鹽酸、氫氧化鈉：以上試劑均為分析純；甲酸、乙腈：以上試劑均為色譜純；Dowex 50WX4 H+型離子交換樹脂、1-L-苯丙氨酸-1-脫氧-D-果糖：純度98%，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 儀器

AR124CN型電子天平、ST3100型pH計(jì) 奧豪斯儀器有限公司；磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；SK5210HP型超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海島通應(yīng)用科技有限公司；EM7KCGW3-NR型微波爐 美的公司；Scientz-30ND冷凍干燥機(jī) 寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；Milli-Q Integral超純水儀 美國(guó)Millipore公司；高效液相色譜儀 Waters科技(上海)有限公司；液相色譜四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)沃特世公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水相制備PDF

1.2.1.1 PDF的常壓不脫水水相制備

以D-葡萄糖和L-苯丙氨酸為原料，配制濃度均為0.2 mol/L的反應(yīng)溶液。將溶液置于磁力攪拌器上攪拌，通過轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)使其溶解，再用6 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。取反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至耐高溫高壓反應(yīng)瓶中，于90 ℃反應(yīng)不同時(shí)間后，立即取出并冰浴終止反應(yīng)，反應(yīng)液保存待測(cè)。

1.2.1.2 微波加熱水相制備PDF

按上述方法配制反應(yīng)溶液，將其轉(zhuǎn)移至反應(yīng)瓶中，在微波功率為500 W條件下反應(yīng)不同時(shí)間后，立即取出并冰浴終止反應(yīng)，反應(yīng)液保存待測(cè)。

1.2.1.3 真空脫水水相制備PDF

按上述方法配制反應(yīng)溶液，將其轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，水浴90 ℃反應(yīng)，并在5 min之內(nèi)脫水完全，反應(yīng)不同時(shí)間后，立即取出并冰浴終止反應(yīng)。反應(yīng)固體樣品用去離子水溶解并定容至原體積，保存待測(cè)。

1.2.2 真空脫水單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)PDF產(chǎn)率的影響

1.2.2.1 不同反應(yīng)溫度的影響

制備方法見1.2.1.3，其中脫水反應(yīng)溫度分別設(shè)定為70，80，90，100 ℃。

1.2.2.2 不同反應(yīng)pH的影響

制備方法見1.2.1.3，用6 mol/L的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液分別調(diào)節(jié)pH至6.5，7.5，8.5，9.5。

1.2.2.3 不同反應(yīng)物配比的影響

制備方法見1.2.1.3，其中苯丙氨酸濃度為0.2 mol/L，苯丙氨酸與葡萄糖的摩爾比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，真空脫水反應(yīng)40 min。

1.2.3 PDF的分離純化

根據(jù)1.2.1.3方法制備得到PDF混合溶液，對(duì)其進(jìn)行分離純化。采用Dowex 50WX4 H+型陽離子交換樹脂為分離介質(zhì)，在其活化完成后進(jìn)行上樣。首先利用去離子水以3 mL/min的速率洗脫以除去未反應(yīng)的葡萄糖，用高效液相色譜-串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)檢測(cè)洗脫液直至葡萄糖沖洗干凈為止，然后用0.18 mol/L的氨水溶液以1 mL/min的速率洗脫并收集洗脫液，用HPLC-ELSD檢測(cè)并合并含有PDF的組分，經(jīng)冷凍干燥后得到淡黃色粉末，置于干燥器中備用。

1.2.4 超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-TOF-MS)分析PDF

取PDF固體粉末配制成溶液，使用UPLC-TOF-MS對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征[10]。

液相色譜條件：色譜儀Waters Acquity UPLC；檢測(cè)器Waters Acquity PDA；分析柱Acquity UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)；流動(dòng)相：A為1%甲酸，B為乙腈；梯度洗脫程序：98%～0% A，梯度洗脫20 min；流速0.3 mL/min；柱溫45 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)200～600 nm；進(jìn)樣體積1 μL。

質(zhì)譜條件：正離子模式電噴霧離子源(ESI+)；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃，氣流量700 L/h；毛細(xì)管電壓3.5 kV；錐孔電壓20 V；探測(cè)器電壓1800 V；錐孔氣流量50 L/h；碰撞能量6 V；質(zhì)量范圍20～1000 m/z。

1.2.5 PDF的HPLC-ELSD定量分析

利用HPLC-ELSD分析PDF，色譜條件：Waters Select C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為1%甲酸，B為乙腈；梯度洗脫程序：98%～90% A，梯度洗脫15 min，流速1 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫45 ℃；檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)；ELSD參數(shù)：漂移管溫度為55 ℃；載氣為氮?dú)猓粴怏w流量為1.5 L/min；增益為1。

以制備的PDF粉末樣品為標(biāo)準(zhǔn)品，配制一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過HPLC-ELSD分析，基于濃度與峰面積的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=4.1548×106x-8.4981×105，R2=0.9922。其中x表示PDF的濃度，y表示峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)PDF進(jìn)行定量分析。PDF的摩爾濃度與苯丙氨酸的初始摩爾濃度的比值即為PDF的產(chǎn)率。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

上述的每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。測(cè)定所得數(shù)據(jù)制作成折線圖并進(jìn)行誤差分析，分析不同制備條件的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDF的UPLC-TOF-MS結(jié)構(gòu)表征

基于PDF定量分析和產(chǎn)率計(jì)算的需要，首先對(duì)分離純化后的PDF固體粉末進(jìn)行UPLC-TOF-MS結(jié)構(gòu)表征，得到PDF的總離子流圖和質(zhì)譜圖，分別見圖1和圖2。

圖1 PDF的總離子流色譜圖Fig.1 The total ion flow chromatogram of PDF

圖2 PDF的質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrogram of PDF

由圖1可知，保留時(shí)間為3.77 min的峰即為純化后的PDF對(duì)應(yīng)的色譜峰。通過計(jì)算PDF與其他雜質(zhì)峰的峰面積可知PDF的純度為98%。由圖2中PDF的色譜圖可知，苯丙氨酸-葡萄糖體系制備得到的美拉德反應(yīng)中間體1-L-苯丙氨酸-1-脫氧-D-果糖的質(zhì)子化分子[M+H]+峰為328，因此推斷其相對(duì)分子質(zhì)量為327，這與理論推算一致，說明其為目標(biāo)產(chǎn)物PDF。此外，質(zhì)子化分子[M+H]+脫去一分子水和兩分子水分別形成m/z=310和m/z=292的離子碎片。m/z=264、m/z=166和m/z=166分別為[M+H-H2O-COOH]+、[AA+H]+和[AA+H-COOH]+的碎片離子，這些均與Davidek等[11]的報(bào)道一致。因此，證實(shí)了PDF的相對(duì)分子質(zhì)量為327，分子式為C15H21NO7。

2.2 不同制備方法對(duì)PDF產(chǎn)率的影響

目前美拉德反應(yīng)中間體的制備方法以有機(jī)相合成法為主，主要以無水甲醇為溶劑，將反應(yīng)底物溶解后加熱回流制備。該反應(yīng)較為激烈，反應(yīng)副產(chǎn)物較多，且有機(jī)溶劑的使用使得制備成本升高，還可能造成污染，因此該方法不適合應(yīng)用于食品中。水相制備法則能夠一定程度上解決有機(jī)相合成法成本高和污染嚴(yán)重的問題，但也存在制備產(chǎn)率較低的缺陷。因此，實(shí)現(xiàn)美拉德反應(yīng)中間體的水相制備并將其開發(fā)為調(diào)味產(chǎn)品應(yīng)用于食品，對(duì)于調(diào)味品的豐富與開發(fā)具有重要價(jià)值。本研究探索了常壓不脫水反應(yīng)、微波加熱反應(yīng)、真空脫水反應(yīng)3種水相制備方法對(duì)苯丙氨酸-葡萄糖體系美拉德反應(yīng)中間體PDF產(chǎn)率的影響。由圖3中(a)可知，隨著90 ℃常壓不脫水反應(yīng)時(shí)間的增加，PDF產(chǎn)率逐漸提升并在160 min后達(dá)到產(chǎn)率最大值1.28%。PDF在生成的同時(shí)，也會(huì)發(fā)生可逆反應(yīng),生成原料苯丙氨酸和葡萄糖以及參與后續(xù)的美拉德反應(yīng)而被消耗，導(dǎo)致常壓不脫水反應(yīng)制備PDF的產(chǎn)率較低，無法真正實(shí)現(xiàn)PDF在食品加工中的應(yīng)用。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，PDF產(chǎn)率逐漸降低，表明此時(shí)PDF降解速率高于生成速率，無法實(shí)現(xiàn)PDF的有效累積，因此不適于PDF的工業(yè)化大量制備。

圖3 不同制備方法對(duì)PDF產(chǎn)率的影響Fig.3 The effects of different preparation methods on the yield of PDF

微波加熱作為近幾年來在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的新型加熱方法，具有高效、環(huán)保、節(jié)能的特點(diǎn)。由圖3中(a)可知，微波加熱下PDF的產(chǎn)率要高于常壓不脫水反應(yīng)，且達(dá)到最大產(chǎn)率的時(shí)間短于常壓不脫水反應(yīng)法，這說明微波加熱促進(jìn)了美拉德反應(yīng)進(jìn)程的進(jìn)行，對(duì)于PDF產(chǎn)率的提升有促進(jìn)作用。這主要是因?yàn)槲⒉訜峋哂休^強(qiáng)的物料穿透能力，能夠顯著增加原料分子的接觸與摩擦，從而促進(jìn)分子之間的相互作用[12]。段鄧樂[13]的研究表明，相比于水浴加熱，微波加熱中游離氨基酸含量減少的更多，早期反應(yīng)程度也更高。顧宗珠等[14]的研究也表明，微波加熱相比于普通加熱方式，可縮短加熱時(shí)間，提高反應(yīng)效率和減少副反應(yīng)的發(fā)生。然而，微波加熱下PDF的最大產(chǎn)率也僅為1.91%，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法達(dá)到有效提升PDF產(chǎn)率的目的。

PDF在水相中無法大量積累的事實(shí)說明PDF的生成速率較慢或降解速率較快。而一系列研究表明美拉德反應(yīng)中間體具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，說明其在較低溫度下降解速率較慢[15-16]。因此，水相制備PDF產(chǎn)率較低的原因推測(cè)為原料苯丙氨酸和葡萄糖轉(zhuǎn)化為PDF的反應(yīng)過程受到限制?；诿览路磻?yīng)歷程分析，苯丙氨酸和葡萄糖縮合形成PDF的過程中脫去一分子水，通過促進(jìn)脫水反應(yīng)的進(jìn)行，則可能實(shí)現(xiàn)PDF產(chǎn)率的有效提升。由圖3中(b)可知，真空脫水反應(yīng)法能夠顯著提升PDF的產(chǎn)率，并在脫水反應(yīng)30 min后達(dá)到最大產(chǎn)率20.01%，說明除去反應(yīng)體系中的水分對(duì)于促進(jìn)苯丙氨酸和葡萄糖向PDF的轉(zhuǎn)化具有顯著的作用。此外，真空脫水顯著降低了制備PDF的時(shí)間，對(duì)于減少經(jīng)濟(jì)成本具有一定優(yōu)勢(shì)。

2.3 真空脫水溫度對(duì)PDF產(chǎn)率的影響

由圖4可知，不同溫度下脫水反應(yīng)初期的產(chǎn)率提升均較慢，這主要是因?yàn)樵撨^程還處在濃縮階段，體系中還存在較多的水分，不利于脫水反應(yīng)的進(jìn)行。脫水溫度為70 ℃時(shí)，PDF的產(chǎn)率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高，但生成速率較慢，說明低溫不利于PDF的生成。當(dāng)脫水溫度為80，90，100 ℃時(shí)，PDF的產(chǎn)率逐漸提升，而后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其產(chǎn)率逐漸降低。這說明脫水反應(yīng)初期PDF的生成速率較快，而反應(yīng)后期PDF的消耗加快，使產(chǎn)率逐漸下降。另外，反應(yīng)溫度越高，PDF產(chǎn)率所能達(dá)到的最高值越大，屆時(shí)所需要的時(shí)間越小，說明溫度的提升有利于苯丙氨酸和葡萄糖向PDF的轉(zhuǎn)化。

圖4 脫水溫度對(duì)PDF產(chǎn)率的影響Fig.4 The effects of dehydration temperatures on the yield of PDF

在美拉德反應(yīng)初級(jí)階段，還原糖的羰基與氨基酸的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)并脫去一分子水產(chǎn)生希夫堿，再環(huán)化形成N-取代醛基胺，該物質(zhì)進(jìn)一步發(fā)生重排后形成美拉德反應(yīng)中間體[17]。反應(yīng)體系中水的存在直接影響著氨基酸和還原糖向美拉德反應(yīng)中間體的高效轉(zhuǎn)化，也是導(dǎo)致水相制備美拉德反應(yīng)中間體產(chǎn)率較低的制約因素。而溫度的提升除了提高脫水的速率外，還能夠有效促進(jìn)N-取代醛基胺向ARP的轉(zhuǎn)化。因此，脫水反應(yīng)對(duì)于提升六碳糖的美拉德反應(yīng)中間體的產(chǎn)率也是有效的。另外，圖4也表明100 ℃脫水反應(yīng)下PDF產(chǎn)率的提升與降低均較快，難以保證制備產(chǎn)率的穩(wěn)定性，且100 ℃真空脫水反應(yīng)條件也不利于控制。因此，從PDF的產(chǎn)率及實(shí)際操作的控制來看，最佳的真空脫水反應(yīng)溫度為90 ℃。

2.4 反應(yīng)初始pH對(duì)PDF產(chǎn)率的影響

在美拉德反應(yīng)過程中，pH值越高，反應(yīng)速率越快，而美拉德反應(yīng)歷程較為復(fù)雜，pH對(duì)不同階段的反應(yīng)速率影響有所差異[18]。

由圖5可知，反應(yīng)體系中pH值對(duì)PDF的產(chǎn)率也有顯著影響。當(dāng)初始pH為6.5時(shí)，PDF的產(chǎn)率逐漸提升，在反應(yīng)60 min后達(dá)到最大值為15.1%，隨著時(shí)間延長(zhǎng),產(chǎn)率逐漸降低。當(dāng)pH為7.5時(shí)，PDF的產(chǎn)率增加較快且在30 min時(shí)達(dá)到20.1%，這說明pH值從酸性到弱堿性的變化過程中有利于PDF產(chǎn)率的提升。酸性條件下，苯丙氨酸上的氨基被質(zhì)子化，導(dǎo)致其親核能力下降，不利于PDF的形成[19]。當(dāng)反應(yīng)體系初始pH為8.5時(shí)，PDF的產(chǎn)率升高較快，且在20 min后達(dá)到產(chǎn)率最高值21.1%，說明隨著溶液由弱堿性逐漸增強(qiáng)的過程中有利于PDF產(chǎn)率的提升。然而，當(dāng)pH值達(dá)到9.5時(shí)，PDF雖然前期升高較快，但其產(chǎn)率最高值僅為16.7%，這可能是因?yàn)閺?qiáng)堿性條件下PDF的消耗較快。Jalbout等[20]的研究表明，堿性條件下有利于提高美拉德反應(yīng)第二階段和第三階段的反應(yīng)速率，從而促進(jìn)PDF的消耗和次級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物的形成。因此，酸性和強(qiáng)堿性均不利于PDF的水相制備，最佳的制備初始pH值選擇8.5。

圖5 反應(yīng)pH對(duì)PDF產(chǎn)率的影響Fig.5 The effects of pH values on the yield of PDF

2.5 苯丙氨酸和葡萄糖摩爾比對(duì)PDF產(chǎn)率的影響

選擇最適的制備溫度90 ℃和pH 8.5為反應(yīng)條件研究苯丙氨酸和葡萄糖的摩爾比對(duì)PDF產(chǎn)率的影響。

由圖6可知，當(dāng)苯丙氨酸和葡萄糖的摩爾比為1∶3時(shí)，PDF的產(chǎn)率最大。隨著底物葡萄糖含量的增加，有效促進(jìn)了苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)了PDF產(chǎn)率的提升。而當(dāng)苯丙氨酸摩爾濃度高于葡萄糖時(shí)，PDF的產(chǎn)率較低。這主要是因?yàn)镻DF的產(chǎn)率以苯丙氨酸的濃度來計(jì)算，在苯丙氨酸摩爾濃度保持一致的情況下，苯丙氨酸和葡萄糖的摩爾比越高，葡萄糖含量越低，因此不利于PDF的生成。此外，當(dāng)苯丙氨酸和葡萄糖摩爾比為1∶2和1∶3時(shí)，PDF產(chǎn)率雖然相比于摩爾比1∶1有所提升，但提升并不明顯。因此，從節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本考慮，選擇苯丙氨酸和葡萄糖摩爾比為1∶1最佳。

圖6 反應(yīng)物摩爾比對(duì)PDF產(chǎn)率的影響Fig.6 The effect of molar ratios of reactants on the yield of PDF

3 結(jié)論

研究表明，PDF的不同水相制備方法對(duì)其產(chǎn)率有重要影響，其中常壓不脫水水相制備法和微波加熱水相制備法的產(chǎn)率較低，而真空脫水水相制備法通過促進(jìn)PDF形成途徑中脫水反應(yīng)的進(jìn)行從而有效提升PDF的產(chǎn)率。當(dāng)真空脫水反應(yīng)溫度為90 ℃，初始反應(yīng)pH為8.5，苯丙氨酸和葡萄糖摩爾比為1∶1時(shí)，PDF的產(chǎn)率最大，并達(dá)到21.1%，相比于常壓水相法PDF產(chǎn)率顯著提升。為對(duì)該法制備的PDF樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，采用了陽離子交換樹脂對(duì)其進(jìn)行分離純化，通過UPLC-TOF-MS鑒定了其純度達(dá)到98%，并明確了相對(duì)分子質(zhì)量為327，分子式為C15H21NO7。