許萬(wàn)星，王 琳，郭巧梅，黃 霞，婁加陶

上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200030

有研究表明，表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(EGFR-TKI)在晚期非小細(xì)胞肺癌的治療中取得突破性進(jìn)展，對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因藥物敏感性的突變患者，EGFR-TKI的療效明顯高于標(biāo)準(zhǔn)化療方案[1-2]。但是約50%耐藥患者經(jīng)EGFR-TKI治療后可檢測(cè)到T790M突變[3]。第三代靶向藥物對(duì)經(jīng)過(guò)第一、二代EGFR-TKI治療后耐藥患者有良好的效果[4]。研究證實(shí)肺癌患者外周血中循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)可用于檢測(cè)EGFR突變和EGFR-TKI療效監(jiān)測(cè)[5-7]。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ctDNA基因突變常用的方法包括超級(jí)擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR(Super-ARMS PCR)、微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)等。Super-ARMS PCR檢測(cè)特異度高，但靈敏度相對(duì)較低[8]。ddPCR檢測(cè)靈敏度高且絕對(duì)定量。本研究以經(jīng)過(guò)EGFR-TKI治療后耐藥的晚期肺腺癌患者為研究對(duì)象，分別采用Super-ARMS PCR和ddPCR檢測(cè)ctDNA中T790M突變，比較2種方法的一致性和檢出率，同時(shí)討論檢出率與用藥時(shí)間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年6月至2019年12月本院確診的肺癌患者124例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理組織和分子分型確認(rèn)為EGFR敏感突變型腺癌；(2)接受EGFR-TKI治療，根據(jù)實(shí)體瘤的臨床療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)新病灶和(或)存在非目標(biāo)病灶進(jìn)展；(2)臨床資料完整，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、病理組織類型、用藥時(shí)間和隨訪等。(3)有充足的血液標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有嚴(yán)重心血管系統(tǒng)疾??；(2)近期內(nèi)使用過(guò)免疫抑制劑。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)?；颊咭话阗Y料見(jiàn)表1。

表1 患者一般資料

1.2儀器與試劑 ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、QubitTM熒光定量?jī)x均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；QX200TMDroplet DigitalTMPCR System ddPCR儀、QX200 Droplet微滴生成儀、微滴閱讀儀、ddPCRTMSupermix for Probes(No dUTP)、ddPCRTMprobe assay Kit均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；OSE-100C恒溫金屬浴購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；YB-DX23D電動(dòng)吸引器購(gòu)自上海斯曼峰有限公司；QIAamp游離核酸純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(多重?zé)晒釶CR法)購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 使用一次性乙二胺四乙酸真空抗凝采血管，采集患者靜脈血8～10 mL，以1 600×g在4 ℃下離心10 min分離上層血漿，以16 000×g在4 ℃下離心10 min，再次分離上層血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆?。血漿需在采集后2 h內(nèi)完成分離。

1.3.2血漿ctDNA提取 取上述血漿4～5 mL，按照QIAamp游離核酸純化試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行血漿ctDNA提取。采用QubitTM熒光定量?jī)x測(cè)定提取的核酸濃度，取吸光度(A260/A280)在1.8～2.0的合格標(biāo)本用于后續(xù)EGFR基因檢測(cè)。

1.3.3EGFR基因檢測(cè) EGFR基因分別使用Super-ARMS PCR法和ddPCR法進(jìn)行檢測(cè)。Super-ARMS PCR法采用人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒。按照操作流程檢測(cè)T790M的突變情況。使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，探針模式設(shè)為Reporter Dye：FAM、VIC、ROX、CY5；Quencher Dye：TAMRA；Passive Reference：NONE?？偡磻?yīng)體系72 μL：2.5 μL P-EGFR反應(yīng)液，67.5 μL待測(cè)樣品；2 μL P-EGFR混合酶。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，15個(gè)循環(huán)；93 ℃ 40 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，28個(gè)循環(huán)；第三階段60 ℃收集FAM/VIC/ROX/CY5信號(hào)。

ddPCR法應(yīng)用ddPCRTM探針檢測(cè)試劑盒。反應(yīng)體系22 μL：EGFR ddPCR Supermix 10 μL,ddPCR T790M探針引物2 μL，待測(cè)DNA 10 μL。將反應(yīng)體系放入8通道微滴生成器中。將生成微滴于QX200TMDroplet DigitalTMPCR System ddPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，70 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；98 ℃溫浴10 min，最后置于4 ℃。PCR反應(yīng)后，將96孔板置于微滴閱讀儀中，檢測(cè)微滴熒光信號(hào)。采用QuantaSofrt軟件分析，2個(gè)及以上微滴出現(xiàn)FAM信號(hào)陽(yáng)性時(shí)，判斷此標(biāo)本為陽(yáng)性，否則為陰性。根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例，即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Super-ARMS PCR法與ddPCR法檢測(cè)結(jié)果比較 124例患者分別進(jìn)行ddPCR法與Super-ARMS PCR法檢測(cè)EGFR基因T790M突變。其中Super-ARMS PCR法檢出T790M突變38例(占30.65%)，ddPCR法檢出T790M突變50例(占40.32%)。2種方法檢測(cè)結(jié)果一致性較好(Kappa=0.756，P<0.001)。ddPCR與Super-ARMS PCR法的陽(yáng)性符合率為74.00%(37/50)，陰性符合率為98.65%(73/74)，總符合率為88.71%(110/124)。14例標(biāo)本在2種檢測(cè)方法中結(jié)果出現(xiàn)差異，其中13例在Super-ARMS PCR法中檢測(cè)為陰性標(biāo)本，在ddPCR法中檢測(cè)為陽(yáng)性標(biāo)本，1例在Super-ARMS PCR法中檢測(cè)為陽(yáng)性標(biāo)本，在ddPCR法中檢測(cè)為陰性標(biāo)本。見(jiàn)表2、3。

表2 Super-ARMS PCR法與ddPCR法檢測(cè)結(jié)果比較(n)

表3 14例檢測(cè)結(jié)果不一致標(biāo)本的信息

2.2T790M檢出率與用藥時(shí)間相關(guān)性 所有患者經(jīng)EGFR-TKI治療后，出現(xiàn)疾病進(jìn)展的用藥時(shí)間中位數(shù)為14個(gè)月。在所有入組患者中，隨著用藥時(shí)間的增加，Super-ARMS PCR法檢出率升高，用藥時(shí)間≥12個(gè)月患者采用Super-ARMS PCR法檢測(cè)T790M突變的檢出率高于用藥時(shí)間<12個(gè)月的患者(P<0.05)，而ddPCR法在不同用藥時(shí)間人群中檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.729)。見(jiàn)表4。

表4 T790M檢出率與用藥時(shí)間的關(guān)系(%)

2.3T790M突變豐度分析 應(yīng)用ddPCR法檢測(cè)出50例T790M突變患者中，突變豐度在0.01%～68.10%。突變豐度≥5%的患者占28.00%(14/50)；突變豐度為1%～<5%的患者占比較高，占38.00%(19/50)；突變豐度<1%的患者占34.00%(17/50)，其中突變豐度≤0.1%的患者占4.00%(2/50)。

3 討 論

隨著腫瘤精準(zhǔn)治療時(shí)代的到來(lái)，分子靶向和免疫治療已經(jīng)成為熱點(diǎn)。由于大部分腫瘤患者在診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期，且預(yù)后較差，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，因此化療成為臨床上主要的治療手段。但是一線含鉑兩藥聯(lián)合化療的有效率也只有35%左右，同時(shí)伴隨十分明顯的藥物不良反應(yīng)。因此，包含EGFR-TKI在內(nèi)的分子靶向藥物為晚期非小細(xì)胞肺癌患者的治療提供了新的方向。盡管EGFR-TKI治療在EGFR突變的腫瘤患者中取得了比較優(yōu)異的成效，但是經(jīng)過(guò)一段時(shí)間治療后，患者均會(huì)出現(xiàn)耐藥情況。第三代EGFR-TKI對(duì)出現(xiàn)T790M突變伴疾病進(jìn)展的耐藥患者有較好的效果。因此在進(jìn)行第三代EGFR-TKI治療前，對(duì)EGFR基因T790M突變的檢測(cè)尤為重要。隨著《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》的頒布[9]，臨床上對(duì)靈敏度較高的檢測(cè)方法的需求更加迫切。目前各實(shí)驗(yàn)室常用的EGFR基因突變檢測(cè)方法包括ARMS PCR、Super-ARMS PCR、ddPCR、新一代測(cè)序(NGS)等[10-11]。由于ctDNA具有片段小、濃度低、易降解的特點(diǎn)，目前針對(duì)ctDNA中EGFR基因突變檢測(cè)并沒(méi)有公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)室前期建立了ctDNA ddPCR和NGS檢測(cè)平臺(tái)，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，ddPCR和NGS的靈敏度基本一致，均可達(dá)0.1%[12]。ddPCR不依賴循環(huán)閾值或內(nèi)參基因，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目，具有絕對(duì)定量、靈敏度高、標(biāo)本需求量低、耐受性高等特點(diǎn)，包括PCR和NGS在內(nèi)的較多分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)會(huì)利用ddPCR進(jìn)行比較和驗(yàn)證。本研究將Super-ARMS PCR法與ddPCR法在ctDNA T790M突變檢出率和一致性方面進(jìn)行了比較和分析。

本研究中ddPCR法和Super-ARMS PCR法檢測(cè)耐藥患者T790M突變檢出率分別為40.32%和30.65%，與研究報(bào)道的數(shù)據(jù)較為一致[13-14]。此外，Super-ARMS PCR法和ddPCR法對(duì)晚期肺腺癌患者經(jīng)EGFR-TKI治療后ctDNA EGFR基因T790M突變檢測(cè)具有較高的一致性(Kappa=0.756，P<0.001)，總符合率為88.71%。其中，13例Super-ARMS PCR法檢測(cè)T790M突變陰性的患者，利用ddPCR法檢測(cè)陽(yáng)性，通過(guò)突變豐度分析，這13例患者的突變豐度較低，在0.01%～2.80%，可能由于Super-ARMS PCR檢測(cè)低突變豐度標(biāo)本時(shí)，其檢測(cè)性能不穩(wěn)定。1例Super-ARMS PCR法檢測(cè)T790M突變陽(yáng)性的患者，利用ddPCR法檢測(cè)陰性，可能由于ddPCR法操作過(guò)程較為復(fù)雜，操作不當(dāng)?shù)纫蛩卦斐蓪?shí)驗(yàn)失敗。

耐藥分為原發(fā)性和獲得性，原發(fā)性耐藥臨床定義為接受EGFR-TKI后第一時(shí)間對(duì)治療無(wú)反應(yīng)，臨床癥狀、疾病控制或總生存率無(wú)明顯改善。獲得性耐藥是指開(kāi)始EGFR-TKI靶向治療后取得明顯治療效果，但服藥6個(gè)月之后，腫瘤病灶不能得到有效抑制，進(jìn)一步增大，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)判定為疾病進(jìn)展。本研究中患者經(jīng)EGFR-TKI治療后，出現(xiàn)疾病進(jìn)展的用藥時(shí)間中位數(shù)為14個(gè)月。在124例患者中，隨著患者用藥時(shí)間的增加，檢出率也有升高，用藥超過(guò)12個(gè)月的患者采用Super-ARMS PCR法檢測(cè)T790M突變的檢出率高于用藥小于12個(gè)月的患者(P<0.01)。說(shuō)明用藥時(shí)間超過(guò)12個(gè)月，產(chǎn)生耐藥性的患者占比較高，提示臨床可以在這段時(shí)間加強(qiáng)隨訪。

本研究應(yīng)用ddPCR法檢測(cè)出50例T790M突變，T790M突變豐度在0.01%～68.10%，其中突變豐度≤0.1%的患者占4.00%。突變豐度在1%～<5%的患者占比最高，占38.00%。當(dāng)患者血漿中的DNA無(wú)法達(dá)到Super-ARMS PCR法所能檢測(cè)的最低限度時(shí)，常被其判為陰性；本研究中，ddPCR法的突變豐度最低可以達(dá)到0.01%，可以檢出Super-ARMS PCR法檢測(cè)為陰性的標(biāo)本。

綜上所述，Super-ARMS PCR法和ddPCR法在經(jīng)EGFR-TKI治療后的晚期肺腺癌患者外周血標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因T790M突變的檢測(cè)中具有較高的一致性，可以為臨床肺腺癌患者靶向治療提供重要參考。但ddPCR法靈敏度更高并且可以通過(guò)絕對(duì)定量提供突變豐度的信息，后續(xù)可針對(duì)突變豐度與患者的用藥療效和預(yù)后開(kāi)展研究，從而為臨床治療提供更全面的信息。