金陳飛，崔夢(mèng)竹，梁紅艷，姜曉峰

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江哈爾濱 150028

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(CAH)是一組由于類固醇激素合成代謝中某種酶缺乏導(dǎo)致皮質(zhì)醇合成障礙為主要特征的常染色體隱性遺傳病，會(huì)導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)生成類固醇激素的水平發(fā)生改變，并且根據(jù)疾病分型不同，激素水平變化有明顯差異。

類固醇激素又稱為甾體激素，是膽固醇經(jīng)一系列酶催化而來(lái)的高效能物質(zhì)，主要分為腎上腺皮質(zhì)激素、性激素和維生素D。各種類固醇激素在體內(nèi)水平極低，一般檢測(cè)水平在nmol/L或pmol/L數(shù)量級(jí)，因此尋找一種可靠、特異的分析方法成為臨床疾病診斷的首要任務(wù)。

目前類固醇激素的檢測(cè)手段主要包括放射免疫分析技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、氣相色譜質(zhì)譜分析法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[1-2]。免疫分析法具備操作簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，然而RAUH[3]研究顯示，免疫分析法靈敏度較低，易引起交叉反應(yīng)造成假陽(yáng)性，無(wú)法同時(shí)檢測(cè)同一標(biāo)本中的多種激素水平，無(wú)法實(shí)現(xiàn)類固醇代謝譜的高效、深入、準(zhǔn)確的研究。WILSON等[4]研究表明，孕酮測(cè)定受不同類固醇(包括17α-羥孕酮、11-去氧皮質(zhì)酮、20-二酮)所引發(fā)的高達(dá)10%的交叉反應(yīng)影響，導(dǎo)致免疫檢測(cè)結(jié)果偏高。而LC-MS/MS憑借高通量、靈敏度高、特異度高、檢測(cè)標(biāo)本多樣、檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍寬等優(yōu)勢(shì)在CAH臨床診斷中的地位越來(lái)越重要[5]。

1 CAH類固醇激素代謝通路及主要的CAH分類

CAH是腎上腺皮質(zhì)功能減退較常見(jiàn)的原因之一。根據(jù)酶缺乏將CAH分為7型，具體各型詳見(jiàn)表1，不同酶缺陷時(shí)呈現(xiàn)不同的生化和臨床表現(xiàn)。腎上腺皮質(zhì)類固醇激素合成代謝途徑見(jiàn)圖1。

表1 常見(jiàn)臨床CAH分型

圖1 腎上腺皮質(zhì)類固醇激素合成代謝途徑

21-OHD是CAH中最常見(jiàn)的類型，臨床可分為3型，分別為失鹽型、單純男性化型及非經(jīng)典型。在腎上腺皮質(zhì)類固醇激素合成代謝途徑中，21-羥化酶催化17-羥孕酮轉(zhuǎn)化為11-脫氧皮質(zhì)醇和催化孕酮轉(zhuǎn)化為11-去氧皮質(zhì)酮，兩者分別為皮質(zhì)醇和醛固酮的前體。因此，CAH患者類型為21-OHD時(shí)皮質(zhì)醇和醛固酮有不同程度的合成不足或完全缺乏，同時(shí)上游底物(17-羥孕酮和孕酮)水平因堆積而明顯升高，因此，17-羥孕酮水平顯著升高成為診斷21-OHD最有意義的指標(biāo)，臨床通常根據(jù)17-羥孕酮水平的改變?cè)u(píng)估治療效果。因此，17-羥孕酮已被大多數(shù)國(guó)家納入新生兒篩查項(xiàng)目，這有助于快速檢測(cè)出21-OHD患兒。然而該項(xiàng)檢查受到較多因素干擾造成檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性高。由于臍帶血中17-羥孕酮水平很高，所以新生兒在出生1～2 d內(nèi)17-羥孕酮往往高于臨界值，并逐漸下降。此外，早產(chǎn)兒和許多因其他疾病引起生理應(yīng)激的足月嬰兒中，17-羥孕酮水平往往比實(shí)際水平高，篩查測(cè)試的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值在早產(chǎn)兒中僅為0.4%，而在足月兒中為30.1%[12-13]，因此建議對(duì)所有17-羥孕酮水平升高的新生兒在1個(gè)月后進(jìn)行第2次LC-MS/MS篩查。

11β-OHD的主要生化異常為低血鉀，但是嚴(yán)重度因基因突變類型而異，甚至可出現(xiàn)血鉀正常的情況。其他生化指標(biāo)變化體現(xiàn)在血17-羥孕酮、雄烯二酮、脫氫表雄酮水平升高，血清皮質(zhì)醇、醛固酮水平降低，血腎素活性減低。此外，該癥的特征性指標(biāo)是血和尿11-脫氧皮質(zhì)醇和去氧皮質(zhì)酮水平升高，尿中二者的主要代謝產(chǎn)物四氫11-脫氧皮質(zhì)醇及四氫去氧皮質(zhì)酮水平升高，這是與21-OHD進(jìn)行鑒別的關(guān)鍵指標(biāo)。

2 LC-MS/MS法檢測(cè)類固醇激素方法學(xué)的建立

目前檢測(cè)類固醇激素的生物標(biāo)本主要有血清、血漿、毛發(fā)[14]、尿液[15]、唾液[16]、子宮內(nèi)膜[17]等。在方法開(kāi)發(fā)建立的過(guò)程中可通過(guò)以下幾個(gè)步驟提高檢測(cè)性能。(1)標(biāo)本處理：良好的標(biāo)本前處理方法可以起到富集目標(biāo)組分、消除或降低基質(zhì)干擾、提高靈敏度的作用，反之則會(huì)容易引入誤差并延長(zhǎng)分析時(shí)間。目前血液中類固醇激素的前處理方法有蛋白質(zhì)沉淀、液液萃取和固相萃取，而多種前處理方法相結(jié)合具有低基質(zhì)效應(yīng)、回收率高、靈敏度高、自動(dòng)及快速等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸受到臨床關(guān)注[18]。(2)檢測(cè)過(guò)程：要針對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目的特點(diǎn)選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相流速、離子源和質(zhì)量分析器，類固醇激素檢測(cè)通常與三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器或三重四級(jí)桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)量分析器串聯(lián)，采用電噴霧離子源或大氣壓化學(xué)電離源，并利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)靶向代謝組進(jìn)行分析，按離子質(zhì)荷比的大小順序進(jìn)行收集和記錄，進(jìn)而得到質(zhì)譜圖用于結(jié)果分析。為了避免內(nèi)源性或外源性基質(zhì)物質(zhì)的干擾，降低待測(cè)物信號(hào)的損失和信號(hào)波動(dòng)，可在同一批分析中的所有標(biāo)本中加入等體積的內(nèi)標(biāo)液，絕大部分待測(cè)物的信號(hào)波動(dòng)和量的損失都可以得到校正。內(nèi)標(biāo)通常分為2型，即結(jié)構(gòu)類似物內(nèi)標(biāo)和同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，在類固醇激素檢測(cè)時(shí)常常選擇同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)[19]。新生兒篩查CAH時(shí)常常檢測(cè)的激素與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)信息見(jiàn)表2。同時(shí)為確保準(zhǔn)確度及批間或批內(nèi)精密度，每次測(cè)量時(shí)均應(yīng)準(zhǔn)備質(zhì)控品。(3)數(shù)據(jù)處理：合理的分析方式能為實(shí)驗(yàn)研究提供更加精準(zhǔn)的結(jié)果，保證結(jié)果的可靠性。質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理一般采用質(zhì)譜儀對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)處理軟件，用空白提取液配制標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，有效排除干擾因素，可以保證高通量、高準(zhǔn)確性的數(shù)據(jù)處理。

表2 新生兒篩查CAH時(shí)常檢測(cè)的激素與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)

續(xù)表2 新生兒篩查CAH時(shí)常檢測(cè)的激素與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)

為了確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，需要對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行性能評(píng)估，主要包括檢測(cè)下限與定量下限、精準(zhǔn)度、線性關(guān)系、選擇性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、表觀回收率、基質(zhì)效應(yīng)等。TRAVERS等[26]建立了LC-MS/MS檢測(cè)血清中15種類固醇激素的方法，采用蛋白質(zhì)沉淀和固相萃取相結(jié)合的方法提取血清甾體化合物和氘化內(nèi)標(biāo)物，回收率從21-脫氧皮質(zhì)醇的64%到皮質(zhì)醇的101%不等，并與免疫分析法比較，2種方法檢測(cè)皮質(zhì)醇，脫氫表雄激素和睪酮的結(jié)果較一致，免疫分析法檢測(cè)醛固酮數(shù)值偏低，孕酮水平低于2 ng/mL的17-羥孕酮、雄烯二酮和11-脫氧皮質(zhì)醇水平明顯偏高。分析這種差異產(chǎn)生的原因：(1)免疫分析法抗體特異性低導(dǎo)致的交叉反應(yīng)，例如來(lái)自胎兒腎上腺區(qū)的類固醇單硫酸鹽，主要是17-羥基孕烯醇酮硫酸鹽導(dǎo)致免疫測(cè)定中17-羥孕酮水平錯(cuò)誤升高[27]；(2)LC-MS/MS在提取過(guò)程中加入了內(nèi)標(biāo)液，可以有效提升檢測(cè)特異性。

3 LC-MS/MS在CAH診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀

新生兒篩查目的在于在癥狀出現(xiàn)之前盡早發(fā)現(xiàn)并準(zhǔn)確診斷CAH等先天性疾病，而通常所用的免疫分析法(一級(jí)篩查)常常出現(xiàn)假陽(yáng)性，增加了患者的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力。2018年由美國(guó)內(nèi)分泌學(xué)會(huì)專家組發(fā)布的21-OHD臨床實(shí)踐指南(第二版)與2010年發(fā)布的第一版指南比較，新增新生兒篩查時(shí)推薦一級(jí)篩查采用常規(guī)方法檢測(cè)17-羥孕酮，并推薦了優(yōu)先采用LC-MS/MS進(jìn)行二級(jí)篩查，不推薦其他方法(如基因分型)，以此提高CAH篩查的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值[28-29]。SCHWARZ等[30]發(fā)現(xiàn)CAH患病率和血清17-羥孕酮水平隨著新生兒體質(zhì)量增加而降低，皮質(zhì)醇的水平隨采樣時(shí)年齡不同而發(fā)生明顯變化，未觀察到17-羥孕酮或雄烯二酮與年齡有明顯相關(guān)性。值得注意的是雄烯二酮是較敏感的雄激素，并且其水平較17-羥孕酮穩(wěn)定，且受皮質(zhì)醇替代治療時(shí)給藥間隔時(shí)間的影響較少，也不受性別、疾病類型和抽血時(shí)間的影響，與17-羥孕酮有較好的相關(guān)性。在這項(xiàng)研究中作者證實(shí)(17-羥孕酮+雄烯二酮)/皮質(zhì)醇是CAH的最佳判別方法，但若二者比值大于4時(shí)需注意是否在采樣之前使用了糖皮質(zhì)激素類藥物，避免假陰性結(jié)果的發(fā)生。

2010年歐洲內(nèi)分泌協(xié)會(huì)臨床指導(dǎo)委員會(huì)制訂的21-OHD臨床應(yīng)用指南[28]指出經(jīng)典型CAH患者17-羥孕酮水平通常高于300 nmol/L，非經(jīng)典型CAH患者17-羥孕酮水平在6～300 nmol/L，當(dāng)17-OHP<6 nmol/L時(shí)不支持CAH診斷。因此根據(jù)17-羥孕酮檢測(cè)水平對(duì)CAH疾病準(zhǔn)確分型，進(jìn)而輔助臨床精準(zhǔn)治療具有重要意義。AMBROZIAK[31]等證明了與LC-MS/MS比較，免疫分析法檢測(cè)17-羥孕酮可能會(huì)增加非經(jīng)典型CAH假陽(yáng)性診斷的風(fēng)險(xiǎn)。由此可見(jiàn)，LC-MS/MS檢測(cè)17-羥孕酮在CAH診斷分型中具有重要意義。

目前，臨床多將17-羥孕酮水平是否升高作為新生兒篩查時(shí)判斷是否患21-OHD的首要指標(biāo)，但表1中其他形式的CAH也可能導(dǎo)致檢測(cè)到17-羥孕酮水平升高[32]。由圖1可看出21-OHD患者缺乏21-羥化酶會(huì)使17-羥孕酮的下游產(chǎn)物11-脫氧皮質(zhì)醇水平降低，21-脫氧皮質(zhì)醇水平升高。因此，有研究者提出21-脫氧皮質(zhì)醇作為21-OHD的另一標(biāo)志物，那么21-脫氧皮質(zhì)醇是否可以在一定程度上取代17-羥孕酮在21-OHD診斷中的地位有待研究。JANZEN等[33]建立的LC-MS/MS不僅避免了免疫分析法診斷CAH時(shí)的假陽(yáng)性高的問(wèn)題，還發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)計(jì)算(17-羥孕酮+21-脫氧皮質(zhì)醇)/皮質(zhì)醇的數(shù)值進(jìn)一步提高LC-MS/MS的靈敏度，在242 500例新生兒中，1 609例初篩試驗(yàn)陽(yáng)性，而通過(guò)計(jì)算確定了其中已確診的16例21-OHD患者，沒(méi)有誤報(bào)。由此可見(jiàn)，在二級(jí)篩查時(shí)可更多關(guān)注21-脫氧皮質(zhì)醇的水平變化，并且選擇合適的計(jì)算公式來(lái)提高檢測(cè)方法的靈敏度，這也為CAH的診斷提供了新思路。

4 結(jié) 論

綜上所述，類固醇激素水平精準(zhǔn)定量檢測(cè)對(duì)于CAH的診斷和確切分型具有重要意義。LC-MS/MS最主要的優(yōu)勢(shì)就是高通量、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)標(biāo)本多樣、檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍寬等，目前有望取代免疫分析法。但由于LC-MS/MS標(biāo)本處理操作復(fù)雜，自動(dòng)化程度較低，需要操作人員進(jìn)行規(guī)范化培訓(xùn)才可應(yīng)用于臨床。因此，簡(jiǎn)化標(biāo)本處理操作流程、實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化是目前面臨的挑戰(zhàn)，也是研究的焦點(diǎn)。