丁海月，薛 冰，刁華瓊，魏 丹，李小黎

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是指分布于神經(jīng)系統(tǒng)的具有自我更新和多分化潛能的干細(xì)胞。其主要功能是作為一種儲備，參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)或細(xì)胞正常死亡的更新。因此，NSCs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病中可能發(fā)揮重要的治療作用[1-2]，如帕金森病、阿爾茨海默病、缺血性腦卒中等疾病[3]。腦內(nèi)海馬區(qū)分布的NSCs較多，尤其海馬齒狀回是哺乳動物腦內(nèi)存在NSCs的主要區(qū)域之一。NSCs的增殖與分化有益于神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育，對學(xué)習(xí)和記憶有著重要的作用[4-5]。然而NSCs的原代培養(yǎng)難度大，細(xì)胞活力低，純度不高。因此，本實驗取新生大鼠海馬組織，總結(jié)一種體外培養(yǎng)海馬NSCs的簡便方法，為進(jìn)一步研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病中NSCs的增殖分化提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生24 h的SD大鼠，普通無特定病原體(SPF)級，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、B27、青鏈霉素(美國Gibco公司)；表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，美國Proteintech公司)；D-Hanks液(美國HyClone公司)；5-嗅-2-脫氧尿苷(5-Bromo-2-deoxy-uridine，BrdU)、二甲基亞砜(DMSO)、多聚賴氨酸(美國Sigma公司)；兔抗巢蛋白(Nestin)抗體、小鼠抗BrdU抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG、Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG(美國Peprotech公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)；激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 海馬NSCs的培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 溶液配制及器材準(zhǔn)備 培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)液、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、2% B27、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)。取材用的手術(shù)器械、玻璃燒杯及玻璃培養(yǎng)皿、濾紙等要提前高壓蒸汽滅菌，然后放置于60 ℃烘箱中干燥4～6 h。

1.3.2 預(yù)處理 鑒定所用的細(xì)胞爬片需要提前用多聚賴氨酸處理，具體步驟為：將細(xì)胞爬片浸在多聚賴氨酸溶液中，常溫放置5 min，然后吸去多余多聚賴氨酸，超凈臺中晾干，然后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次，晾干備用。

1.3.3 取材及培養(yǎng) 新生24 h的SD大鼠，用75%的乙醇浸泡消毒10 min后剪下大鼠頭部，移入放有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中(濾紙用于吸去多余血水)。彎鑷夾住大鼠眼眶以固定頭部，用眼科剪從斷頭切口的中線將頭皮和顱骨剪至嗅球部，用另一把鑷子將頭皮及顱骨向兩側(cè)掀開，暴露出大小腦及延髓，用鑷子夾斷正前方嗅球與全腦的連接，并從側(cè)面輕輕將全腦與腦底分離，小心將全腦取出放入一個盛有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中。因左右大腦相連，用游絲鑷在大腦皮層背側(cè)表面正中矢狀位夾斷，使左右腦分開，并向外側(cè)小心掀開大腦皮質(zhì)表面，即可見“C”形海馬臥在皮層內(nèi)，用游絲鑷夾斷海馬前后及邊緣組織，即可分離出整個海馬，然后將周圍的腦膜剝離干凈(以見不到含有血管的腦膜為佳)，將剝離出的海馬單獨放置在盛有DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。將海馬組織剪成1 mm3大小的組織塊，吹打40～60次，制成細(xì)胞懸液，過40 μm細(xì)胞篩，收集入離心管中，1 000 r/min室溫離心5～10 min，加培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再反復(fù)吹打20次，取少量細(xì)胞懸液加在計數(shù)板上，在顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞密度，以1.5×105～2.5×105個/mL接種于培養(yǎng)皿或25 mL的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d半量換液，5～7 d可傳代1次，每天在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.3.4 鑒定 取傳代后第3天的海馬NSCs，在培養(yǎng)皿中加入BrdU，終濃度為10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后再接種到放有預(yù)先處理過多聚賴氨酸的細(xì)胞爬片的6孔板中，孵育24 h使細(xì)胞貼壁。在培養(yǎng)板中將已經(jīng)爬好細(xì)胞的玻片用PBS洗3次，每次5 min；用4%多聚甲醛常溫固定30 min，PBS洗3次，每次5 min；用含0.3%的TritonX-100的PBS溶液室溫破膜30 min，PBS洗3次，每次5 min；含10%山羊血清的PBS液室溫下封閉1 h，除去山羊血清，不洗；分別滴加用PBS稀釋后的兔抗Nestin單克隆抗體(1∶100)、小鼠抗BrdU抗體(1∶200)4 ℃過夜，清洗3次后，分別加入含F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔、Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶100)的PBS溶液，室溫避光1 h，清洗3次后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

2 結(jié) 果

2.1 NSCs的生長情況 第1天可見細(xì)胞懸浮生長，形態(tài)不一，體積微小，有少量大小不等的片狀物及雜質(zhì)，因細(xì)胞是懸浮生長，所以培養(yǎng)基的每個層面都存在細(xì)胞，鏡下會很密集(圖1A)。第3天可見片狀物減少，雜質(zhì)越來越少，大量的單個細(xì)胞懸浮生長，細(xì)胞呈球形(圖1B)。第5天可見細(xì)胞數(shù)量增多，體積變大，多個神經(jīng)球易聚集形成細(xì)胞團(tuán)似桑葚樣，細(xì)胞團(tuán)體積大小各不相同，周圍有新增殖的體積相對較小的神經(jīng)球，無明顯的片狀物，雜質(zhì)細(xì)胞越來越少(圖1C)。當(dāng)神經(jīng)球中心開始變黃變暗時需要傳代，若繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞球很可能貼壁分化，每5～7 d可傳代1次。

圖1 海馬NSCs生長情況(×200)

2.2 NSCs的鑒定 將第2代培養(yǎng)的NSCs懸液行Nestin、BrdU的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。鑒定結(jié)果表明，培養(yǎng)的NSCs呈Nestin陽性(圖2A)；部分細(xì)胞檢測為BrdU陽性(圖2B)；說明本實驗方法培養(yǎng)出的細(xì)胞為NSCs且具有增殖能力。詳見圖2。

圖2 海馬NSCs鑒定(×600)

3 討 論

NSCs是一類能夠向特定類型神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的原始細(xì)胞的總稱，對NSCs的研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)中重要的領(lǐng)域。有研究發(fā)現(xiàn)，NSCs移植治療神經(jīng)退行性疾病在動物模型中顯示出有益的作用[6]。王凌飛[7]認(rèn)為NSCs移植治療具有保護(hù)血腦屏障、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生等作用，是治療缺血性腦卒中的有效方法。NSCs用于神經(jīng)功能障礙等疾病的治療具有廣闊的開發(fā)前景，一直以來都是研究的重點方向。

本實驗中海馬組織的正確取出對細(xì)胞的培養(yǎng)極為重要，因為鼠腦的海馬組織過小，肉眼難以分辨，且腦組織柔軟，易融為一體，所以原代培養(yǎng)取材難度大，且純度不夠高，雜質(zhì)細(xì)胞多，成活率低。研究表明用新生鼠培養(yǎng)NSCs取材相對簡單，且不易造成污染，選用孕鼠海馬的取材難度大[8]。這是因為新生鼠與孕鼠相比腦組織更大，易分辨，操作更容易，不易損傷，獲得的海馬組織更多更完整，從而使得培養(yǎng)的細(xì)胞無其他混雜細(xì)胞的生長，純度高，因此，本實驗選用新生鼠作為細(xì)胞培養(yǎng)的來源。其次，腦組織易融化，取材過程在冰盒上進(jìn)行，所用到的試劑要提前預(yù)冷，低溫能保持海馬形態(tài)，同時提高細(xì)胞活力。取出的全腦要放在盛有無酚紅的D-Hanks液中，無色透明的D-Hanks液可以使全腦的形態(tài)完整呈現(xiàn)出來，即肉眼下就可操作而不用借助解剖顯微鏡，避免污染，相比苗宗寧等[9]在顯微鏡下操作更簡便。按照本實驗方法取材，可以清楚地看到海馬的位置，能較完整地剝離出海馬，縮短取材時間，快速培養(yǎng)，可以用于培養(yǎng)海馬NSCs，選用不同的培養(yǎng)基也可用來培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，NSCs不斷增殖，周圍雜質(zhì)逐漸減少，純度不斷增加，其關(guān)鍵在于海馬組織的完整性。培養(yǎng)的第一代NSCs經(jīng)臺盼藍(lán)染色計數(shù)細(xì)胞存活率高達(dá)96%，與實驗過程中的操作有關(guān)，動作越輕柔，細(xì)胞損傷越小，取材速度越快，細(xì)胞活性越高。Nestin是目前作為識別NSCs的重要標(biāo)志蛋白，Nestin陽性細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征。BrdU可以替代胸腺嘧啶在細(xì)胞增殖時期滲入DNA，是反映增殖能力的重要指標(biāo)。本實驗對第二代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示幾乎所有的細(xì)胞都呈Nestin陽性，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs，且純度較高，大部分細(xì)胞呈BrdU陽性，顯示NSCs具有較強(qiáng)的增殖力。

中醫(yī)藥治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有一定的優(yōu)勢，在動物實驗中發(fā)現(xiàn)中藥可以誘導(dǎo)體內(nèi)海馬NSCs增殖分化，從而保護(hù)腦損傷[10]。有研究者在離體實驗中通過培養(yǎng)NSCs來探討中藥對疾病的治療作用。陳琳等[11]發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對缺糖缺氧-再灌注損傷新生大鼠海馬NSCs具有保護(hù)作用；Han等[12]建立糖尿病腦病的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)降糖膠囊對海馬NSCs存活、自我更新和分化產(chǎn)生積極作用；為了探討補(bǔ)益脾胃元氣類方藥治療阿爾茨海默病的作用，岳濤等[13]研究方藥對海馬NSCs增殖分化的影響。因此，培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的NSCs是關(guān)鍵，為下一步探討中藥對海馬NSCs增殖分化的作用提供支持。

綜上所述，本實驗以新生大鼠培養(yǎng)海馬NSCs，對海馬的損傷小，細(xì)胞活力高，并且操作簡便，降低了原代取材的難度。細(xì)胞的成功培養(yǎng)為下一步的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。