張明磊，楊清泉，李貞彩，王 星，張一帆

急性心肌梗死是臨床常見的一種心血管疾病，心肌缺氧、缺血可引發(fā)心肌炎等病理變化，氧自由基生成量增加可造成心肌損傷，還可破壞心血管結(jié)構(gòu)及功能，同時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)還可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡從而造成心肌細(xì)胞損傷[1-2]。因此，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有助于保護(hù)心肌組織及避免心肌損傷，從而降低急性心肌梗死等心血管疾病發(fā)生率。過氧化氫(H2O2)可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷[3]。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)可調(diào)控H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000418539.1(LncRNA ENST00000418539.1)在穩(wěn)定性冠心病病人單核細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可能作為穩(wěn)定性冠心病診斷的潛在指標(biāo)[5]。通過生物信息學(xué)分析顯示，微小RNA-24(microRNA-24，miR-24)可能是ENST00000418539.1的靶基因，研究表明，miR-24在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并可能參與心肌細(xì)胞損傷過程[6]。但ENST00000418539.1是否可通過調(diào)控miR-24的表達(dá)影響H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷尚未可知。因此，本研究采用H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞建立細(xì)胞損傷，探討ENST00000418539.1對(duì)心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響，探究其對(duì)miR-24的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。H2O2購(gòu)自河北健寧藥業(yè)有限公司；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Trizol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；ENST00000418539.1小分子干擾RNA(si-ENST00000418539.1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-24寡核苷酸模擬物(miR-24 mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)、miR-24特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-24)及陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific protease-3，Caspase-3)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶9(cysteinyl aspartate-specific protease-9，Caspase-9)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞接種于96孔板(5×104個(gè)/孔)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使用200 μmol/L H2O2處理心肌細(xì)胞48 h[7]，作為模型組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。通過Lipofectamine2000試劑分別將si-NC、si-ENST00000418539.1、si-ENST00000418539.1與anti-miR-NC、si-ENST00000418539.1與anti-miR-24轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，使用200 μmol/L H2O2處理心肌細(xì)胞48 h，分別記作si-NC組、si-ENST00000418539.1組、si-ENST00000418539.1+anti-miR-NC組、si-ENST00000418539.1+anti-miR-24組。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中ENST00000418539.1、miR-24的表達(dá)水平 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA。應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。ENST00000418539.1正向引物5′-CCACTAGATCGAGGTGCTTGG-3′，反向引物5′-GGTGGTACCGGAGGGAATCT-3′；miR-24正向引物5′-GTCCAGATCACCCTCACCTC-3′，反向引物5′-CAGAAAACTGC AAACGAGGC-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGT CGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循環(huán)。ENST00000418539.1以GAPDH為內(nèi)參，miR-24以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算ENST00000418539.1、miR-24相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min離心10 min，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC與5 μL PI，充分混勻，室溫振蕩孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 檢測(cè)MDA、LDH水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，參照試劑盒檢測(cè)MDA、LDH水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)ENST00000418539.1的靶基因 starBase預(yù)測(cè)顯示ENST00000418539.1與miR-24存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，分別將含有結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)的序列插入熒光素酶報(bào)告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-ENST00000418539.1、突變型載體MUT-ENST00000418539.1，分別將miR-NC、miR-24 mimics與WT-ENST00000418539.1、MUT-ENST00000418539.1共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá) 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞，加入400 μL RIPA裂解液，冰上孵育30 min，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min離心6 min，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，加入ECL化學(xué)發(fā)光劑，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2凋亡及Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，Caspase-3、Caspase-9蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組、si-NC組比較，si-ENST00000418539.1組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，Caspase-3、Caspase-9蛋白水平降低(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2凋亡及Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

表1 干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2凋亡及Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響(x±s，n=9)

2.2 干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2中MDA、LDH表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組MDA、LDH水平升高(P<0.05)；與模型組、si-NC組比較，si-ENST00000418539.1組MDA、LDH水平降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2中MDA、LDH表達(dá)的影響(x±s，n=9)

2.3 ENST00000418539.1靶向miR-24 starBase預(yù)測(cè)顯示ENST00000418539.1與miR-24存在靶向關(guān)系，詳見圖2。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-ENST00000418539.1的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與miR-NC組比較，miR-24組熒光素酶活性降低(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-ENST00000418539.1的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-24組熒光素酶活性與miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。與si-NC組比較，si-ENST00000418539.1組細(xì)胞中miR-24的表達(dá)水平升高(P<0.05)。詳見表4。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(x±s，n=9)

表4 miR-24的表達(dá)(x±s，n=9)

圖2 ENST00000418539.1靶向miR-24

2.4 干擾miR-24能逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2凋亡的影響 與si-ENST00000418539.1+anti-miR-NC組比較，si-ENST00000418539.1+anti-miR-24組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。詳見圖3、表5。

圖3 干擾miR-24能逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2凋亡及Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

表5 干擾miR-24能逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2凋亡的影響(x±s，n=9)

2.5 干擾miR-24能逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2中MDA、LDH表達(dá)水平的影響 與si-ENST00000418539.1+anti-miR-NC組比較，si-ENST00000418539.1+anti-miR-24組MDA、LDH水平升高(P<0.05)。詳見表6。

表6 干擾miR-24能逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2中MDA、LDH表達(dá)的影響(x±s，n=9)

3 討 論

氧自由基生成與清除失衡后可引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，心血管疾病發(fā)生時(shí)可產(chǎn)生氧自由基而加重心肌細(xì)胞氧化損傷，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此，抑制氧化應(yīng)激可減少心肌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療心血管疾病的目的[8-9]。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)異常可參與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程[10-12]。但仍有部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA在心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，H2O2可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中ENST00000418539.1表達(dá)上調(diào)，提示ENST00000418539.1在H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明，Caspase-3、Caspase-9表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，H2O2處理后心肌細(xì)胞凋亡率升高，Caspase-3、Caspase-9表達(dá)上調(diào)，而干擾ENST00000418539.1表達(dá)后細(xì)胞凋亡率降低，Caspase-3、Caspase-9表達(dá)下調(diào)，提示干擾ENST00000418539.1表達(dá)可降低H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率。研究表明，MDA含量升高可加重氧化損傷，LDH水平升高可促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]。本研究結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中MDA、LDH水平升高，而干擾ENST00000418539.1表達(dá)后MDA、LDH水平降低，提示干擾ENST00000418539.1表達(dá)可降低MDA、LDH水平從而減輕氧化應(yīng)激損傷。

為探究ENST00000418539.1是否通過調(diào)控miR-24表達(dá)參與心肌細(xì)胞損傷過程，本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)ENST00000418539.1可靶向結(jié)合miR-24，并可負(fù)向調(diào)控miR-24的表達(dá)。研究表明，miR-24上調(diào)表達(dá)可減輕心肌缺血再灌注損傷[15]。miR-24通過靶向BIM減輕心肌細(xì)胞凋亡[16]。miR-24抑制POZ/BTB表達(dá)可保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受糖尿病損害[17]。miR-24表達(dá)異?？蓞⑴c心肌細(xì)胞凋亡過程[18]。本研究將si-ENST00000418539.1與anti-miR-24共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，隨后使用H2O2處理，結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率升高，Caspase-3、Caspase-9表達(dá)上調(diào)，MDA、LDH水平升高，提示干擾miR-24能逆轉(zhuǎn)干擾ENST00000418539.1對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、LDH的作用。

綜上所述，干擾ENST00000418539.1表達(dá)后H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率降低，氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、LDH水平降低，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-24表達(dá)有關(guān)，可為進(jìn)一步揭示心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。