宋月芹, 宋智煜, 董鈞鋒, 陳慶霄, 孫會忠

(河南科技大學(xué)林學(xué)院, 河南洛陽 471023)

雙委夜蛾Athetisdissimilis隸屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)委夜蛾屬Athetis，是我國重要的農(nóng)業(yè)害蟲，對小麥、玉米、花生、大豆和甘薯等作物造成嚴重損失。該害蟲主要分布于中國、日本、朝鮮、印度、印度尼西亞和菲律賓等國家(Takahashi, 1975; Banetal., 1998; Choetal., 2010; 李靜雯等, 2012)。雙委夜蛾首次在山東威海玉米地發(fā)現(xiàn)為害(李靜雯等, 2012)，隨后在河南、陜西和安徽等地也陸續(xù)出現(xiàn)該蟲的報道(宋月芹等, 2015; 段愛菊等, 2016; 郭婷婷等, 2016a, 2016b)。雙委夜蛾幼蟲和成蟲在外形上與二點委夜蛾Athetislepigone極其相似，為害特征也相同，常隱蔽在秸稈、落葉和雜草中，在田間與二點委夜蛾混合發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計，近6年二點委夜蛾為害面積近220萬hm2，缺苗率高達70%以上，給玉米產(chǎn)量造成巨大損失(王振營等, 2012)，而其中可能有一部分是雙委夜蛾為害的。在室內(nèi)用玉米苗飼養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，雙委夜蛾的幼蟲食量、幼蟲取食期和產(chǎn)卵量遠大于二點委夜蛾(郭婷婷等, 2016a)。在田間，農(nóng)民常將雙委夜蛾與二點委夜蛾混在一起防治，長期施用廣譜性殺蟲劑使害蟲極易產(chǎn)生抗藥性，防治效果下降，對人畜不安全還污染環(huán)境。目前國內(nèi)外專家通過研究昆蟲基因功能等方面，以探索新型的對害蟲專一性強、對人畜安全的綠色防控技術(shù)，已經(jīng)取得了一定進展，而目前雙委夜蛾這方面的研究較少。

昆蟲具有靈敏的嗅覺系統(tǒng)，可以通過嗅覺精準地定位到配偶、寄主植物以及天敵(Leal, 2013)，因此人們?yōu)榱吮Ｗo環(huán)境，探索新型害蟲防治技術(shù)，對昆蟲有關(guān)嗅覺基因開展了大量研究。如氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)(Gaoetal., 2018; Zhangetal., 2019; 鞏雪芳等, 2020; Wangetal., 2020)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)(Qiuetal., 2018; Alietal., 2019)、嗅覺受體(olfactory receptors, ORs)(陳麗慧等, 2019; Tiwarietal., 2019)、味覺受體(gustatory receptors, GRs)(Poudeletal., 2015; Liuetal., 2020)、離子型受體(ionotropic receptors, IRs)(Abuinetal., 2019)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)(胡穎穎等, 2013; Blankenburgetal., 2019)和氣味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)(Prestwich, 1987; Chertempsetal., 2015)等。其中OBPs是一類可溶性的小分子蛋白，在昆蟲觸角感器中高度表達，為氣味識別的第一步(Pelosi and Maida, 1995)。根據(jù)半胱氨酸的數(shù)量，將OBPs分為5類：含有6個保守半胱氨酸位點的Classic OBPs；在第6個半胱氨酸后面多2～3個半胱氨酸殘基，并且還有一個保守的脯氨酸位點的Plus-C OBPs；只有4個或5個半胱氨酸的Minus-C OBPs；具有2個典型半胱氨酸排列模式的Dimer OBPs；基因序列較長，特征不明顯的Atypical OBPs(Zhangetal., 2013; McKenzieetal., 2014; Guetal., 2015)。

關(guān)于昆蟲觸角中OBPs的研究很多(Fanetal., 2011; Costa-da-Silvaetal., 2013; Ishidaetal., 2013; Duetal., 2019)，但對昆蟲精巢中OBPs的報道很少。Li等(2008)發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊AedesaegyptiOBP22蛋白在雄蛾生殖器內(nèi)大量表達，并在交配過程中將該蛋白轉(zhuǎn)運到雌蛾的腹部末端和受精囊中，推測該蛋白可能作為某種信息素的載體，類似于脊椎動物的尿液和唾液。Sun等(2012)研究發(fā)現(xiàn)OBP10蛋白在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera和煙青蟲H.assulta雄蛾昆蟲的精液中也大量表達，交配后將該蛋白轉(zhuǎn)移到雌蛾生殖器內(nèi)，隨著精子與卵細胞的結(jié)合傳遞給受精卵，推測該蛋白可能攜帶保護卵的防御物質(zhì)十二碳烯(dodecene)，在雌雄成蟲交配時傳遞給受精卵，避免受孕雌蛾在其附近產(chǎn)卵，從而減少了種群內(nèi)和種群之間的自相殘殺。同樣，我們前期在對雙委夜蛾OBPs研究時，也發(fā)現(xiàn)AdisOBP6在精巢中大量表達，其表達量遠大于在觸角中的(Sunetal., 2016)。為了進一步弄清AdisOBP6的表達規(guī)律，我們通過原核表達和抗體制備，用熒光定量PCR和Westen blot印跡方法分別對AdisOBP6在mRNA和蛋白水平上的表達情況進行分析，為今后進一步研究AdisOBP6基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究中所用的雙委夜蛾來自河南科技大學(xué)林學(xué)院昆蟲實驗室，該群體自2017年7月在洛陽周邊玉米田誘集成蟲，然后在室內(nèi)繼代飼養(yǎng)至今。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為：溫度27±1℃，相對濕度80%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 AdisOBP6蛋白的結(jié)構(gòu)分析

首先確定模板，將AdisOBP6(GenBank登錄號: ALZ45421.1)氨基酸序列提交到Meta(http:∥bioinfo.pl/meta)在線網(wǎng)站，尋找同源序列，同源性在30%以上的氨基酸序列就可以作為模板用于三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建；然后采用Discover Studio 2.0軟件工具中的Homology模塊中的Modeler程序，以已知三維結(jié)構(gòu)的同源序列模板預(yù)測AdisOBP6蛋白的三維結(jié)構(gòu)。為了模擬蛋白的真實性，需要將目的蛋白的信號肽去除，根據(jù)模擬3D結(jié)構(gòu)的得分情況，選取得分最高的結(jié)構(gòu)作為最終結(jié)構(gòu)。同時將比對文件用ESPript 3.0軟件進行二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化(Robert and Gouet, 2014)。

1.3 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

收集雙委夜蛾羽化后第3天的雌雄成蟲觸角、末齡幼蟲精巢(因為幼蟲雌雄難辨，我們采用隨機方法解剖，以觀察到精巢為準)、化蛹第3天的精巢以及成蟲羽化后第1, 2, 3和5天的精巢，還有未受精卵和受精卵。將雙委夜蛾各部分組織解剖后立即浸在液氮中的1.5 mL離心管內(nèi)，然后保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

總RNA的提取采用RNAiso Plus Kit(TaKaRa，北京)試劑盒進行，并使用RNase-free DNase I(TaKaRa，北京)對提取的RNA進行除DNA處理。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c分光光度計(Thermo Scientific)進行質(zhì)量檢測。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，北京)試劑盒對RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

1.4 重組表達載體的構(gòu)建

去掉AdisOBP6蛋白序列N端信號肽，在蛋白C端加入His標簽和終止密碼子TAA，序列經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，并添加NdeI/XhoI為酶切位點序列(引物中下劃線序列)，由上海生工合成引物序列，AdisOBP6-NdeI-F： 5′-CCCATATGGGAGCCTGGATG AACTG-3′； AdisOBP6-XhoI-R： 5′-CCCTCGAGGGGA TGATGGTGATGATGT-3′。以1.3節(jié)合成的雙委夜蛾末齡幼蟲精巢cDNA為模板，用帶有NdeI和XhoI酶切位點的AdisOBP6特異引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL, dNTPs (2.5 μmol/L)1.6 μL,ExTaqDNA聚合酶(TaKaRa，大連)0.2 μL, 10×ExTaqbuffer 2 μL, ddH2O為12.2 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。膠回收目的片段，將目的片段克隆到pMDTM19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒。將該質(zhì)粒酶切后，用T4 DNA連接酶連接到酶切過的pET-28a(+)載體上，克隆到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂板過夜后挑去陽性克隆，搖菌提取組合后的pET-28a/AdisOBP6質(zhì)粒，雙酶切測序檢測，挑取正確的質(zhì)粒備用。

1.5 AdisOBP6重組蛋白的表達、純化及抗原制備

取1 μL重組的pET-28a/AdisOBP6質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布在LB固體培養(yǎng)基(含卡那霉素)上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性單菌落于5 mL的LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中37℃ 220 r/min搖菌培養(yǎng)過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液按1∶100(v/v)比例接種于3 L的LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，37℃ 220 r/min培養(yǎng)，當OD值達到0.6時，添加終濃度為0.5 mmol/L IPTG，220 r/min，20℃和37℃分別誘導(dǎo)過夜，離心收集細胞菌體。

將收集的菌液超生破碎，4℃ 12 000 r/min離心20 min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE蛋白電泳檢測蛋白的可溶性。采用鎳瓊脂糖親和層析法純化蛋白，用20, 50和500 mmol/L咪唑洗脫，純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測后，在1×PBS(pH 7.4)中4℃透析過夜，再用PEG20000濃縮，0.45 μm濾膜過濾后，進行SDS-PAGE電泳檢測。檢測合格后，分裝1 mL/管，共5管，-80℃凍存，用于抗體制備。

1.6 AdisOBP6抗體的制備

初免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化，二免、三免、終免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化，免疫新西蘭大白兔4次。采用ELISA法檢測抗體效價，將AdisOBP6抗體分別稀釋后，在450 nm的波長下測OD值，血清效價值≥2.5×陰性值為合格。檢測抗體為陽性后保存于-80℃?zhèn)溆?。抗體由生工生物工程(上海)股份有限公司制備。

1.7 AdisOBP6表達譜測定

熒光定量PCR在StepOne Plus型熒光定量PCR(ABI， Foster， CA， 美國)儀器上進行操作，使用2×SG Fast qPCR Master Mix(High Rox，B639273，BBI)試劑盒測定。雙委夜蛾AdisGAPDH(GenBank登錄號: KT361883)基因作為內(nèi)參基因。采用Primer3在線工具設(shè)計引物，AdisOBP6正向引物： 5′-AGACAGAAGACAATGCCTGACAGTG-3′；反向引物： 5′-CTGACCTCAACATCATTCACGCTT-3′。AdisGADPH正向引物： 5′-CTGCTCATTTAGAGGGTGGTGC-3′；反向引物： 5′-TCTTCTGGGTAGCGGTGGTAG-3′。 將1.3節(jié)合成的cDNA樣品稀釋10倍作為模板上機檢測。PCR反應(yīng)體系: SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL, 正反引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA模板(200 ng/μL)2 μL, 7.2 μL ddH2O補齊至20 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性5 s, 60℃退火并延伸30 s, 共45個循環(huán)。熔點曲線設(shè)置為95℃持續(xù)15 s，降到60℃持續(xù)60 s，再升到95℃保持15 s。每個組織3次生物學(xué)重復(fù)，每生物學(xué)重復(fù)雌雄觸角各來自50頭個體、不同時期的精巢來自20頭個體、受精卵和非受精卵各500粒，技術(shù)重復(fù)3次。以雙委夜蛾雌成蟲觸角中基因表達量為對照，利用相對表達量公式2-ΔΔCt進行計算(Livak and Schmittgen, 2001)。

提取雙委夜蛾羽化后第3天的雌雄成蟲觸角、末齡幼蟲精巢、化蛹第3天的精巢以及成蟲羽化后第1, 2, 3和5天的精巢，還有未受精卵和受精卵10種組織的總蛋白，每種組織重復(fù)3次。蛋白變性后，使用5%濃縮膠和15%的分離膠進行SDS-PAGE蛋白電泳。然后在200 mA電流下持續(xù)50 min，進行轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液，室溫搖床封閉2 h，一抗(AdisOBP6抗體)孵育4℃過夜，二抗37℃搖床孵育2 h。ECL顯色曝光，拍照。為了檢測樣品蛋白情況，用小鼠單抗β-actin(預(yù)實驗顯示蛋白表達穩(wěn)定)做一抗為對照組，進行Westen blot檢測。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0(IBM, Chicago, IL, 美國)軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey氏HSD法進行差異顯著性分析，P<0.05表示樣品間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 AdisOBP6的結(jié)構(gòu)特征

通過結(jié)構(gòu)比對得出AdisOBP6與岡比亞按蚊AnophelesgambiaeAgamOBP4結(jié)構(gòu)最為相似，該結(jié)構(gòu)為X衍射得到的蛋白結(jié)構(gòu)，可靠性強，因此選擇AgamOBP4的結(jié)構(gòu)作為AdisOBP6的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測模板。比對可見，AdisOBP6具有氣味結(jié)合蛋白保守的6個半胱氨酸，并具有7個α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖1: A, B)，蛋白N端和C端明顯可見(圖1: B)，通過表面結(jié)構(gòu)模擬，可見α-螺旋形成一個結(jié)合口袋，用于運輸氣味分子(圖1: C)。

圖1 雙委夜蛾AdisOBP6二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)模擬圖

2.2 原核表達載體的構(gòu)建和鑒定

用帶有酶切位點的引物PCR擴增重組質(zhì)粒pET-28a/AdisOBP6，如圖2所示，在400 bp左右的地方出現(xiàn)目的條帶，與理論大小基本相符合。挑選pET-28a/AdisOBP6陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒小提后分別用NdeI和XhoI進行雙酶切鑒定，出現(xiàn)5 kb和400 bp左右的兩個序列片段，與預(yù)測目的條帶的結(jié)果相一致。

圖2 pET-28a/AdisOBP6重組質(zhì)粒PCR(A)和酶切鑒定(B)

2.3 AdisOBP6重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達

為了達到理想的表達效果，我們采用小樣分別在20℃和37℃條件下用IPTG(0.5 mmol/L)誘導(dǎo)。從圖3中可知，在20℃條件下，誘導(dǎo)效果最佳，目的蛋白表達量最高。在20℃和37℃條件下蛋白都大量表達在上清中，沉淀中很少，說明蛋白主要為可溶性蛋白。

2.4 AdisOBP6蛋白純化

SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，在20 mmol/L咪唑洗脫時出現(xiàn)單一清晰的目的條帶，隨著咪唑濃度增加條帶清晰度越來越低(圖4: A)；將透析和濃縮后的純化蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，AdisOBP6蛋白條帶清晰，雜帶少，說明蛋白純化效果較好(圖4: B)。

2.5 AdisOBP6抗體特異性

ELISA法測定抗體的效價，吸光值隨著抗體稀釋倍數(shù)的增加逐漸降低；4次重復(fù)的抗體分別稀釋到512 000, 512 000, 512 000和64 000倍時，抗體效價值≥2.5×陰性值。為了鑒定所制備的AdisOBP6抗體的特異性，以Western blot法檢測抗體對AdisOBP6重組蛋白的識別(圖5)，結(jié)果顯示，重組蛋白與AdisOBP6抗體很好地結(jié)合在一起，說明該抗體確實為AdisOBP6抗體，故所制備的抗體可用于AdisOBP6功能的相關(guān)研究。

圖3 重組蛋白AdisOBP6的SDS-PAGE電泳檢測

2.6 AdisOBP6基因在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上的表達譜

熒光定量PCR結(jié)果顯示，AdisOBP6在雙委夜蛾精巢中的表達量遠高于在觸角中的，在幼蟲期的精巢中AdisOBP6就已經(jīng)開始表達，蛹期表達量顯著低于幼蟲期的(P<0.05)。成蟲羽化后，AdisOBP6在精巢中的表達量逐漸進入高峰。未受精卵和受精卵中AdisOBP6幾乎不表達或表達量極低(圖6: A)。

Western blot檢測分析發(fā)現(xiàn)，AdisOBP6蛋白主要在精巢中表達，在雌雄成蟲觸角、受精卵和未受精卵中表達量很低。在幼蟲精巢中AdisOBP6蛋白就開始表達一直延續(xù)到成蟲期，在成蟲期精巢AdisOBP6的表達量達到高峰(圖6: B)。

圖4 AdisOBP6蛋白純化(A)和濃縮后(B)的SDS-PAGE電泳檢測

圖5 Western blot檢測抗體對重組蛋白AdisOBP6的特異性

圖6 雙委夜蛾AdisOBP6基因在mRNA(A)和蛋白(B)水平上的表達譜

3 討論

目前獲得蛋白三維結(jié)構(gòu)的方法主要是核磁共振(NMR)和X-射線衍射等方法，昆蟲多種氣味結(jié)合蛋白三維結(jié)構(gòu)也被解析(Sandleretal., 2000; Lartigueetal., 2002; Leeetal., 2002; Pesentietal., 2009)。從昆蟲氣味結(jié)合蛋白三維結(jié)構(gòu)來看，OBPs包含有6個α-螺旋，并命名為α1, α2, α3α, α4α, α5和α6，其中α1和α3, α3和α6, 以及α5和α6分別連接成3個二硫鍵支撐蛋白結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，并且圍成一個口袋形狀，將親水性氨基酸分布到口袋外面，疏水氨基酸分布在口袋內(nèi)，形成疏水性口袋，主要用于結(jié)合一些親脂性氣味分子，將這些氣味分子轉(zhuǎn)運到受體上(Jiangetal., 2009; Xuetal., 2010)。采用同源建模的方法，特別是序列一致性較高時，能夠準確預(yù)測到OBPs的三維結(jié)構(gòu)，促進OBPs功能的研究。我們通過序列比對，AdisOBP6與岡比亞按蚊AgamOBP4氨基酸序列一致性最高，并進行同源建模，預(yù)測了AdisOBP6的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)AdisOBP6具有7個α-螺旋。昆蟲OBPs的構(gòu)象變化具有pH依賴性(Xuetal., 2010; Tianetal., 2016)，在pH酸性條件下，氨基酸序列的C端形成第7個α-螺旋占據(jù)結(jié)合腔釋放配體；pH中性時，第7個α-螺旋從結(jié)合腔排出，漏出結(jié)合腔內(nèi)的疏水性殘基，重新結(jié)合氣味分子(Xu and Leal, 2008; Xuetal., 2010)，此現(xiàn)象并非所有鱗翅目OBPs共有。

原核表達蛋白純化是直接關(guān)聯(lián)著后期蛋白功能的研究，當前對原核表達可溶性His標簽融合蛋白純化最常用的方法是鎳瓊脂糖親和層析法純化蛋白。該方法容易獲得高純度的蛋白，純化效率高，操作方便。然而在原核表達的時候經(jīng)常出現(xiàn)包涵體，還需經(jīng)過變性復(fù)性才能恢復(fù)生物活性(張庶民和祁自柏, 1995)，操作復(fù)雜。因此在原核表達時，經(jīng)常降低溫度，以便使蛋白盡量為可溶性蛋白。本研究采用不同溫度(20℃和37℃)進行原核表達，結(jié)果表明兩種溫度下都能成功表達出可溶性的AdisOBP6蛋白(圖3)，且在20℃時蛋白表達量更高。此研究為后期進行結(jié)合實驗等蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。

昆蟲大多數(shù)OBPs主要表達在觸角中，也有少量OBPs在頭、口器、足、翅和中腸等非嗅覺器官中表達(Zhuetal., 2013; Liuetal., 2015; 鞏雪芳等, 2020)，暗示它們可能還參與了除嗅覺以外其他的生理功能。例如，黑花蠅Phormiaregina的OBP56a在口器中高度表達，推測對膳食脂肪酸具有增溶作用(Ishidaetal., 2013)；埃及伊蚊的OBP45在卵巢中大量表達，可能參與卵膜的形成(Costa-da-Silvaetal., 2013)；中華蜜蜂Apisceranacerana的OBP15在足中特異性高度表達，推測可能在采集花粉和花蜜時用于味覺的識別(Duetal., 2019)。我們發(fā)現(xiàn)AdisOBP6基因在精巢中大量表達，并且在幼蟲期AdisOBP6就已經(jīng)開始表達，蛹期表達量低于幼蟲期，成蟲期表達量逐漸進入高峰，未受精卵和受精卵中AdisOBP6幾乎不表達或表達量極低；Western blot印跡試驗也證實了，AdisOBP6蛋白在精巢中大量表達，但在觸角、受精卵和未受精卵中幾乎沒有檢測到AdisOBP6蛋白的存在(圖6)，推測AdisOBP6可能參與了授精過程。同樣，埃及伊蚊的OBP22和棉鈴蟲、煙青蟲的OBP10也在精液中高度表達(Lietal., 2008; Sunetal., 2012)，具體的生理功能只是推測，還需要進一步去證實。

本研究成功地純化出AdisOBP6可溶性蛋白，并制備了相應(yīng)的抗體，同時針對AdisOBP6在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上的表達情況進行了研究，為今后研究AdisOBP6在雙委夜蛾精巢內(nèi)的具體生理功能奠定了基礎(chǔ)，同時也豐富了昆蟲氣味結(jié)合蛋白基因功能的認識。