王宏民, 趙義濤, 郭 恒, 張仙紅,*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院, 山西太谷 030801; 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山西太谷 030801)

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella為十字花科蔬菜的主要害蟲(chóng)，是目前農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)中交互抗藥譜最廣、抗性水平最高、抗性發(fā)展速度最快的害蟲(chóng)之一。因此，應(yīng)用新型生物農(nóng)藥防治小菜蛾已成為必然的趨勢(shì)。蟲(chóng)生真菌是一類(lèi)重要的昆蟲(chóng)病原微生物，在持續(xù)控制害蟲(chóng)、保護(hù)生態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要作用。玫煙色棒束孢Isariafumosoroseus作為一種重要的蟲(chóng)生真菌，能寄生鱗翅目、鞘翅目和膜翅目等8目的多種有害昆蟲(chóng)(Zimmermann, 2008)。但由于其殺蟲(chóng)速度緩慢、防效不穩(wěn)定等因素，嚴(yán)重制約了其在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用。蟲(chóng)生真菌孢子在昆蟲(chóng)體表的成功附著和萌發(fā)是其侵染害蟲(chóng)的關(guān)鍵，但由于孢子懸浮液潤(rùn)濕性和分散性差，直接噴施于靶標(biāo)植物和害蟲(chóng)時(shí)，在植物和蟲(chóng)體表面的附著率低，從而導(dǎo)致蟲(chóng)生真菌侵染率降低、殺蟲(chóng)速度下降。因此如何提高真菌孢子在植物表面的穩(wěn)定持留量及蟲(chóng)體體表的附著率是提高蟲(chóng)生真菌防治效率的關(guān)鍵。

表面活性劑是殺蟲(chóng)劑中除載體之外的最重要的一類(lèi)助劑(姜虹等, 2020)，它可通過(guò)降低藥液的表面張力和接觸角(Wirthetal., 1991; 顧中言等, 2006)，提高殺蟲(chóng)劑在靶標(biāo)植物上的穩(wěn)定持留量，從而提高其有效利用率(朱金文等, 2004; 閻世江等, 2017)，目前在化學(xué)殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。據(jù)施辰子等(2009)報(bào)道，井岡霉素、殺蟲(chóng)單等可溶性粉劑及井岡·蠟芽菌、甲維·毒死蜱等復(fù)配農(nóng)藥中添加高活性9708表面活性劑，顯著減少農(nóng)藥流失，防蟲(chóng)效果提高12%～26%；啶菌噁唑中添加烷基酚聚氧乙烯醚(NP-7)和辛基苯基聚氧乙烯醚(Triton X-100)等表面活性劑顯著提高了其防效(劉鵬飛等, 2010)；高效氯氟氰菊酯中加入有機(jī)硅表面活性劑，顯著提高了對(duì)螺旋粉虱Aleurodicusdispersus的防治效果，毒效比達(dá)6.07(黃超福等, 2010)；有機(jī)硅表面活性劑Silwet 618可使啶蟲(chóng)脒防治蚜蟲(chóng)的增效作用提高210.2倍(李北興等, 2017)；咪草煙中添加有機(jī)硅表面活性劑Silwet L-77可顯著提高其毒力(Reddy and Singh, 1992; Singh and Singh, 2008)?？梢?jiàn)，表面活性劑有效提高了化學(xué)農(nóng)藥的利用效率，但表面活性劑是否會(huì)提高蟲(chóng)生真菌對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)的防效目前還未見(jiàn)報(bào)道。

我們的前期研究表明，添加125 mg/L的聚二甲基硅氧烷(OFX-0193)和250 mg/L的二異丁基萘磺酸鈉(Nekal)表面活性劑后明顯提高了玫煙色棒束孢Isariafumosoroseus在小菜蛾寄主植物葉片上的穩(wěn)定持留量，并對(duì)真菌孢子的活性無(wú)影響(趙義濤等, 2020)。那么添加表面活性劑是否也會(huì)改善玫煙色棒束孢孢子在小菜蛾幼蟲(chóng)體表的附著量，提高其防治效果?為此，本研究采用掃描電鏡，觀察了添加OFX-0193和Nekal這兩種表面活性劑后玫煙色棒束孢孢子懸浮液在小菜蛾幼蟲(chóng)體表不同部位的孢子附著量、孢子的萌發(fā)速率及侵染過(guò)程，從而為提高蟲(chóng)生真菌的有效利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

供試蟲(chóng)源為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱利用甘藍(lán)葉片飼養(yǎng)多代的小菜蛾，飼養(yǎng)條件：溫度26±1℃，相對(duì)濕度75%～80%，光周期14L∶10D。取個(gè)體大小一致、健康的3齡幼蟲(chóng)供試。

1.2 孢子懸浮液的制備

將4℃下貯存的玫煙色棒束孢PF904菌株在室溫下活化1 d，接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，用接菌針把孢子慢慢刮下，用清水反復(fù)沖洗，渦旋振蕩器打散15 min，兩層紗布過(guò)濾菌絲，制成濃度為2×107孢子/mL的孢子懸浮液。將前期篩選出的表面活性劑OFX-0193和Nekal添加到玫煙色棒束孢PF904菌株孢子懸浮液中，分別配制為含OFX-0193(終濃度125 mg/L)和Nekal(終濃度250 mg/L)的2種孢子懸浮液(2×107孢子/mL)；以添加清水的孢子懸浮液(2×107孢子/mL)為對(duì)照。

1.3 供試藥液侵染的小菜蛾幼蟲(chóng)感病癥狀觀察

采用坡塔噴霧器將1.2節(jié)制備的供試菌液及對(duì)照分別噴施于小菜蛾3齡幼蟲(chóng)體表，接菌后在26±1℃和相對(duì)濕度75%±5%條件下飼養(yǎng)，定時(shí)更換新鮮甘藍(lán)葉片。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)20頭幼蟲(chóng)。接菌后每12 h觀察1次小菜蛾幼蟲(chóng)的感病癥狀。

1.4 小菜蛾幼蟲(chóng)體表孢子附著及萌發(fā)情況的掃描電鏡觀察

小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的接菌及飼養(yǎng)方法同1.3節(jié)，接菌3 h后取樣一次，分別在小菜蛾幼蟲(chóng)體表各結(jié)構(gòu)區(qū)隨機(jī)選取(1×1) mm2統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量，每個(gè)區(qū)域重復(fù)5次，并計(jì)算平均值，統(tǒng)計(jì)小菜蛾幼蟲(chóng)體表不同部位的玫煙色棒束孢PF904孢子附著量。

此后每12 h取樣1次，觀察小菜蛾幼蟲(chóng)體表不同部位玫煙色棒束孢PF904孢子萌發(fā)情況。樣品用2.5%的戊二醛-磷酸緩沖液固定，放入4℃的冰箱過(guò)夜，依次用70%, 80%, 85%, 90%和95%的乙醇溶液對(duì)其進(jìn)行梯度脫水，每次脫水15 min，各濃度重復(fù)脫水3次，用100%的乙醇脫水2次，每次15 min，最后用丙酮置換30 min，系列處理后，將干燥后的小菜蛾幼蟲(chóng)用雙面導(dǎo)電膠固定在掃描電鏡的樣品臺(tái)上，日立E-1010離子濺射儀噴金鍍膜，在掃描電鏡(S-4800；日本日立公司)下拍照觀察。

1.5 添加不同表面活性劑的孢子懸浮液對(duì)小菜蛾致病力的測(cè)定

挑選個(gè)體大小、活力一致的小菜蛾3齡幼蟲(chóng)，采用坡塔噴霧器將1.2節(jié)配制的添加表面活性劑OFX-0193(125 mg/L)和Nekal(250 mg/L)的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液和對(duì)照分別噴施于小菜蛾幼蟲(chóng)體表，置于皿底墊有濕潤(rùn)濾紙片的直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，于26±1℃和75%～80%相對(duì)濕度下進(jìn)行飼養(yǎng)，并用吸足標(biāo)準(zhǔn)十字花科營(yíng)養(yǎng)液的棉球包裹甘藍(lán)葉片的葉柄。每處理20頭幼蟲(chóng)，重復(fù)5次。接菌后每12 h觀察1次，記錄蟲(chóng)體感病癥狀和死亡蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算死亡率、化蛹率和致死中時(shí)(LT50)，收集的死蟲(chóng)(證明幼蟲(chóng)是被玫煙色棒束孢菌絲致病而死)置于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，25℃保濕培養(yǎng)，未感病的幼蟲(chóng)(用于觀察對(duì)照組與處理組中的畸形蛹)飼養(yǎng)至羽化為止。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Adobe Photoshop CS6處理圖片，使用DPS7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性檢驗(yàn)用LSD法，顯著性水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 小菜蛾3齡幼蟲(chóng)感染添加表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株后的感病癥狀

圖1 小菜蛾3齡幼蟲(chóng)感染玫煙色棒束孢PF904菌株不同時(shí)期的外部癥狀

以添加125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液處理小菜蛾幼蟲(chóng)后，蟲(chóng)體的感病癥狀如圖1所示。在染病初期，蟲(chóng)體的外部形態(tài)、取食和對(duì)外界刺激的反應(yīng)等均與未感病幼蟲(chóng)無(wú)差別。接菌12 h，對(duì)照組蟲(chóng)體體表未見(jiàn)黑斑(圖1: A)，而處理組蟲(chóng)體體表局部出現(xiàn)針孔般大小的黑斑(圖1: D)；接菌24 h，對(duì)照組中蟲(chóng)體體表出現(xiàn)少量黑斑(圖1: B)，而處理組黑斑明顯增多，且部分蟲(chóng)體頭部向上翹起，身體產(chǎn)生不正常的抽搐行為(圖1: E)；接菌36 h，處理組感病幼蟲(chóng)體色為黃褐色，蟲(chóng)體呈油浸狀，幼蟲(chóng)取食明顯減少或停止取食，對(duì)外界刺激反應(yīng)明顯遲鈍，腹側(cè)的黑化斑點(diǎn)全面擴(kuò)散(圖1: G)；接菌72 h，處理組部分蟲(chóng)體發(fā)生皺縮(圖1: H)，少數(shù)感病蟲(chóng)體瀕臨死亡，部分蟲(chóng)體化蛹時(shí)間提前，且多數(shù)為畸形蛹(圖1: F)，化蛹后很快死亡。接菌96-144 h后，死亡蟲(chóng)尸僵化，體表被粉白色氣生菌絲覆蓋(圖1: I)。

2.2 表面活性劑對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)體表不同結(jié)構(gòu)區(qū)玫煙色棒束孢PF904孢子附著量的影響

以添加125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液接菌到小菜蛾幼蟲(chóng)體表后，孢子在小菜蛾幼蟲(chóng)體表不同部位的附著量如表1所示。添加Nekal(250 mg/L)和OFX-0193(125 mg/L)的孢子懸浮液，其孢子在小菜蛾幼蟲(chóng)體表刺狀突起結(jié)構(gòu)區(qū)(圖2: D, G)的附著量分別為12.5和9.4個(gè)/mm2，在平緩結(jié)構(gòu)區(qū)(圖2: E, H)的附著量分別為16.2和12.4個(gè)/mm2，在嵴狀突起結(jié)構(gòu)區(qū)(圖2: F, I)的附著量分別為30.1和24.8個(gè)/mm2；2種處理在小菜蛾幼蟲(chóng)體表不同結(jié)構(gòu)區(qū)的孢子附著量均顯著高于對(duì)照(圖2: A-C)，其中添加Nekal(250 mg/L)效果最佳，在小菜蛾幼蟲(chóng)體表3種部位的孢子附著量分別為對(duì)照的2.19, 1.78和1.94倍，可見(jiàn)，供試的2種表面活性劑可顯著提高玫煙色棒束孢在小菜蛾幼蟲(chóng)體表的孢子附著量。

2.3 表面活性劑對(duì)玫煙色棒束孢PF904菌株在小菜蛾3齡幼蟲(chóng)體表不同結(jié)構(gòu)區(qū)萌發(fā)和侵入的影響

玫煙色棒束孢對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)體壁的侵染需經(jīng)過(guò)分生孢子附著、萌發(fā)、產(chǎn)生芽管和附著胞及穿透體壁等過(guò)程(陳巍巍和馮明光, 1999)。掃描電鏡觀察顯示，以添加125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液接菌12 h后，大量的分生孢子成功附著于幼蟲(chóng)體表，部分孢子萌發(fā)并形成芽管(圖3: D, G)，而對(duì)照中的分生孢子未萌發(fā)(圖3: A)；接菌24 h后，對(duì)照中分生孢子開(kāi)始萌發(fā)并形成芽管(圖3: B)，而添加表面活性劑的處理組中芽管出現(xiàn)膨大結(jié)構(gòu)形成附著胞，部分孢子向雙向萌發(fā)后侵入幼蟲(chóng)體腔(圖3: E, H)；接菌36 h后，添加表面活性劑明顯促進(jìn)了菌絲的生長(zhǎng)，處理組(圖3: F, I)菌絲長(zhǎng)度顯著大于對(duì)照組的(圖3: C)； 接菌48 h后，蟲(chóng)體表面附著大量萌發(fā)的菌絲。

表1 添加表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株在小菜蛾3齡幼蟲(chóng)體表不同結(jié)構(gòu)區(qū)的孢子附著量

圖2 添加表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株在小菜蛾3齡幼蟲(chóng)體表不同結(jié)構(gòu)區(qū)的孢子附著量

圖3 添加表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株侵染不同時(shí)間在小菜蛾3齡幼蟲(chóng)體表不同結(jié)構(gòu)區(qū)的萌發(fā)和入侵過(guò)程

2.4 表面活性劑對(duì)玫煙色棒束孢PF904菌株對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)致病力的影響

由表2可知，添加不同表面活性劑后玫煙色棒束孢PF904菌株對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的毒力及致病速率存在顯著差異。添加Nekal(250 mg/L)和OFX-0193(125 mg/L)的玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液比對(duì)照對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的致病速率顯著提高，處理組幼蟲(chóng)24 h后體表出現(xiàn)明顯的感病癥狀，72 h出現(xiàn)死亡高峰， Nekal(250 mg/L)處理組中的致死中時(shí)為2.71 d，OFX-0193(125 mg/L)處理組中的致死中時(shí)為2.95 d；而對(duì)照組在36 h后出現(xiàn)感病癥狀，96 h出現(xiàn)死亡高峰，致死中時(shí)為4.10 d(表2)。添加不同表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904使小菜蛾幼蟲(chóng)的校正死亡率和化蛹率存在顯著差異(P<0.05)，Nekal(250 mg/L)處理組中小菜蛾幼蟲(chóng)的校正死亡率可達(dá)79.2%，化蛹率為19.6%，且12.4%為畸形蛹；OFX-0193(125 mg/L)處理組中幼蟲(chóng)的校正死亡率為65.7%，化蛹率為23.6%，可見(jiàn)玫煙色棒束孢PF904孢子懸浮液中添加這2種表面活性劑均可提高其致病力。

表2 添加不同表面活性劑的玫煙色棒束孢PF904菌株對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的致病力

3 討論

表面活性劑可通過(guò)改善農(nóng)藥藥液在靶標(biāo)上的分布、附著、滲透等，降低藥液的表面張力，促進(jìn)藥液在靶標(biāo)表面的潤(rùn)濕展布和沉積量，從而提高農(nóng)藥的利用率(Taylor, 2011; Xuetal., 2011)。玫煙色棒束孢侵染靶標(biāo)害蟲(chóng)，需經(jīng)過(guò)孢子附著-萌發(fā)-穿透體壁才能有效侵染害蟲(chóng)，因此體壁上孢子的附著數(shù)量及萌發(fā)率是影響其致病力的主要因素。但由于昆蟲(chóng)體壁為疏水性，水溶性的孢子懸浮液噴施后常易滾落而使蟲(chóng)體表面孢子附著量減少。本研究結(jié)果表明，添加250 mg/L Nekal和125 mg/L OFX-0193表面活性劑的玫煙棒束孢PF904菌株在小菜蛾幼蟲(chóng)體表不同部位的孢子附著量為對(duì)照的1.36～2.19倍(圖2)?？梢?jiàn)，供試的2種表面活性劑可顯著提高蟲(chóng)生真菌玫煙色棒束孢孢子在小菜蛾幼蟲(chóng)體表的附著量。

據(jù)趙義濤等(2020)報(bào)道，離體條件下，添加表面活性劑OFX-0193和Nekal對(duì)玫煙色棒束孢孢子的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用。本研究表明，以添加表面活性劑125 mg/L OFX-0193和250 mg/L Nekal的玫煙色棒束孢孢子懸浮液處理小菜蛾3齡幼蟲(chóng)后，蟲(chóng)體表面出現(xiàn)黑斑的時(shí)間均比對(duì)照組顯著提前，且其他感病癥狀也明顯早于對(duì)照(圖1)。此外，室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)表明，添加表面活性劑OFX-0193和Nekal的處理組比對(duì)照對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的致死中時(shí)縮短了1.39～1.51 d(表2)。這可能由于添加表面活性劑一方面提高了小菜蛾幼蟲(chóng)體表的孢子附著量，同時(shí)也促進(jìn)了孢子的萌發(fā)，因此顯著提高了玫煙色棒束孢對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的侵染速率。

據(jù)邱占奎等(2006)報(bào)道，10%吡蟲(chóng)啉可濕性粉劑添加0.05%～0.1%表面活性劑Silwet408顯著提高了小麥蚜蟲(chóng)的防治效果；單提升等(2019)研究表明，添加表面活性劑Greenwet 7618后，四氯蟲(chóng)酰胺50%的推薦用量對(duì)菜青蟲(chóng)仍有很好的防治效果。本研究表明，添加250 mg/L Nekal和125 mg/L OFX-0193表面活性劑后，玫煙色棒束孢對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的致死率均顯著高于對(duì)照(表2)。這與王靜和朱九生(2016)報(bào)道的添加表面活性劑Silwet 408和Silwet 312對(duì)阿維菌素防治小菜蛾具有增效作用及封云濤等(2017) 報(bào)道的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑(ME)中加入有機(jī)硅表面活性劑Silwet 408可顯著提高其對(duì)小菜蛾防治效果的研究結(jié)果相一致。