范小雪, 杜 宇, 張文德, 王 杰, 蔣海賓, 范元嬋, 馮睿蓉,萬(wàn)潔琦, 周紫彧, 熊翠玲,2, 鄭燕珍,2, 陳大福,2,3, 郭 睿,2,3,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所, 福州 350002;3. 福建農(nóng)林大學(xué)蜂產(chǎn)品加工與應(yīng)用教育部工程研究中心, 福州 350002)

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)Nosemaceranae是一種專(zhuān)性侵染成年蜜蜂中腸上皮細(xì)胞的單細(xì)胞真菌病原，可對(duì)蜜蜂宿主造成腸道破壞、能量脅迫、免疫抑制、消化紊亂及壽命縮短等不良影響(Higesetal., 2007; Mayack and Naug, 2009; Alauxetal., 2010; Botíasetal., 2013; Chenetal., 2013)，但到目前為止二者互作的分子機(jī)制尚未闡明。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為18～25 nt且高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)(Bartel, 2004)，可通過(guò)靶向結(jié)合mRNA使其降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮廣泛而重要的生物學(xué)功能(Pillai, 2005)。此外，miRNA已被證實(shí)能夠作為媒介介導(dǎo)真菌病原及其宿主的互作(Linetal., 2016; Crostonetal., 2018)。2012年，張辰宇團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)植物來(lái)源的miR-168a可在動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定積累表達(dá)，并通過(guò)靶向抑制小鼠低密度脂蛋白LDLRAP1的表達(dá)水平，降低小鼠血漿LDL的去除率，首次證實(shí)miRNA的跨界調(diào)控作用(Zhangetal., 2012)。較多的研究證實(shí)結(jié)果表明小RNA(small RNA, sRNA)可在真菌病原及其宿主之間雙向傳播，真菌病原可將sRNA作為效應(yīng)因子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)，參與宿主的基因表達(dá)調(diào)控，從而影響自身毒力、宿主免疫力以及疾病進(jìn)程等。例如，灰霉菌Botrytiscinerea和球孢白僵菌Beauveriabassiana來(lái)源的sRNA在細(xì)胞囊泡的包裹和保護(hù)作用下轉(zhuǎn)移到宿主體內(nèi)，通過(guò)與宿主Argonaute 1蛋白結(jié)合并劫持宿主RNAi機(jī)制，進(jìn)而選擇性沉默宿主免疫基因，以達(dá)到有效感染的目的(Weibergetal., 2013; Cuietal., 2019)。對(duì)于miRNA介導(dǎo)的西方蜜蜂Apismellifera及東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)互作，前人開(kāi)展了少量研究(Evans and Huang, 2018; Huangetal., 2019)，但總體進(jìn)展緩慢。前期研究中，筆者所在團(tuán)隊(duì)聯(lián)用鏈特異性建庫(kù)的RNA-seq和small RNA-seq(sRNA-seq)技術(shù)對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染7 d和10 d的意大利蜜蜂Apismelliferaligustica工蜂中腸及未感染中腸進(jìn)行測(cè)序，基于高質(zhì)量的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)系統(tǒng)解析了lncRNA, miRNA及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答(Chenetal., 2019; 付中民等, 2019)；此外，還在lncRNA, miRNA和mRNA組學(xué)水平深入分析和探討了東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染意大利蜜蜂工蜂的分子機(jī)制(耿四海等, 2020a, 2020b)。近期，筆者所在團(tuán)隊(duì)基于已獲得的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染及未感染的意大利蜜蜂工蜂中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(付中民等, 2019)以及純凈的病原孢子全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(耿四海等, 2020a)篩選出宿主的差異表達(dá)miRNA(differentially expressed miRNA, DEmiRNA)和病原的差異表達(dá)mRNA(differentially expressed mRNA, DEmRNA)，通過(guò)生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)宿主DEmiRNA和病原DEmRNA的靶向關(guān)系，并對(duì)二者間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了構(gòu)建和分析，進(jìn)一步結(jié)合本團(tuán)隊(duì)的前期研究結(jié)果和前人的相關(guān)研究結(jié)果探討了意大利蜜蜂工蜂的DEmiRNA對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)基因和通路的調(diào)控作用(未發(fā)表數(shù)據(jù))。在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的基因組大大簡(jiǎn)化，多數(shù)物質(zhì)和能量代謝的途徑丟失，其增殖高度依賴宿主細(xì)胞提供物質(zhì)和能量(Burrietal., 2006)。同時(shí)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)也進(jìn)化出一些特殊的能力，能夠?qū)λ拗鞯纳砩δ苓M(jìn)行操縱，如東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染可對(duì)西方蜜蜂工蜂造成較強(qiáng)的能量脅迫，致使宿主的能量代謝速率加快且糖水的攝入量提高(Antúnezetal., 2009; Chenetal., 2013)。然而，對(duì)于東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)通過(guò)何種方式和機(jī)制對(duì)西方蜜蜂的基因表達(dá)和生理活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控，相關(guān)研究仍然匱乏，迄今僅有一例報(bào)道(Evans and Huang, 2018)。此前，Evans和Huang(2018)通過(guò)高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析方法在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)感染的西方蜜蜂工蜂中腸中預(yù)測(cè)出病原的6條miRNA，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其中5條miRNA不僅能靶向病原本身的1 545條mRNA，還可能被分泌到宿主細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，通過(guò)靶向918條宿主mRNA調(diào)控宿主的新陳代謝、細(xì)胞凋亡和免疫防御等過(guò)程。

本研究擬通過(guò)比較分析篩選出侵染意大利蜜蜂工蜂的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的DEmiRNA以及意大利蜜蜂工蜂響應(yīng)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染的意大利蜜蜂DEmRNA，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)病原DEmiRNA靶向的宿主mRNA和DEmRNA，并通過(guò)注釋數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相應(yīng)的功能和通路信息，進(jìn)一步結(jié)合東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染西方蜜蜂的生物學(xué)背景，筆者所在課題組的前期研究結(jié)果以及前人的相關(guān)研究結(jié)果深入探討東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的DEmiRNA對(duì)意大利蜜蜂工蜂中腸基因表達(dá)的調(diào)控作用。研究結(jié)果可為探明東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的侵染機(jī)制、東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)-意大利蜜蜂工蜂互作機(jī)制提供重要的參考信息和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的miRNA組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)源

前期研究中，筆者所在課題組分別提取了3個(gè)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的純凈孢子樣品NcCK(NcCK1, NcCK2, NcCK3)的總RNA，并按照已建立的方法(耿四海等, 2020a)構(gòu)建了相應(yīng)的cDNA文庫(kù)，單端測(cè)序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成，測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq。通過(guò)連續(xù)比對(duì)西方蜜蜂參考基因組(Assembly Amel_4.5)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)、Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)及東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)參考基因組(Assembly ASM98816v1)篩濾得到比對(duì)上東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)參考基因組的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)純凈孢子miRNA組學(xué)數(shù)據(jù)(NcCK)，侵染意大利蜜蜂工蜂7 d(NcT1)和10 d(NcT2)的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)miRNA組學(xué)數(shù)據(jù)(耿四海等, 2020a)。測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，NcCK的Bioproject登記號(hào)為PRJNA395264。通過(guò)對(duì)下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控得到了最終的有效標(biāo)簽序列(clean tags)(耿四海等, 2020a)。

1.2 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的DEmiRNA篩選

按照耿四海等(2020a)的方法進(jìn)行東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)miRNA的鑒定和表達(dá)量計(jì)算以及NcCKvsNcT1和NcCKvsNcT2比較組顯著性DEmiRNA的篩選，篩選出的顯著性DEmiRNA(|log2fold change|≥1且P≤0.05)用于本研究中靶向意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA和DEmRNA的預(yù)測(cè)和分析。

1.3 意大利蜜蜂工蜂中腸的mRNA組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)源

筆者所在團(tuán)隊(duì)前期已對(duì)接種50%(w/v)蔗糖溶液7 d(AmCK1)和10 d(AmCK2)的意大利蜜蜂工蜂中腸樣品以及接種含東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)孢子的50%(w/v)蔗糖溶液7 d (AmT1)和10 d(AmT2)的意大利蜜蜂工蜂中腸樣品進(jìn)行RNA抽提、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控(付中民等, 2019)。測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，Bioproject號(hào)為PRJNA395264。質(zhì)控后的意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA組學(xué)數(shù)據(jù)可用于本研究中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著性DEmiRNA的靶標(biāo)預(yù)測(cè)及分析。

1.4 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA的預(yù)測(cè)

為探究1.2節(jié)篩選出的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)DEmiRNA調(diào)控意大利蜜蜂工蜂中腸基因表達(dá)的廣泛性，利用TargetFinder軟件(Allenetal., 2005)預(yù)測(cè)NcCKvsNcT1和NcCKvsNcT2比較組中顯著性DEmiRNA靶向的1.3節(jié)的意大利蜜蜂工蜂中腸的全部mRNA，采用默認(rèn)參數(shù)。

1.5 意大利蜜蜂工蜂中腸響應(yīng)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染的DEmRNA的篩選及分析

miRNA一般對(duì)基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控(Pillai, 2005)，故差異變化趨勢(shì)相反的miRNA-mRNA關(guān)系有重要意義。因此，本研究對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)上調(diào)miRNA-意大利蜜蜂工蜂下調(diào)mRNA、東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)下調(diào)miRNA-意大利蜜蜂工蜂上調(diào)mRNA關(guān)系進(jìn)行重點(diǎn)分析和探討。采用FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)法計(jì)算和歸一化基因表達(dá)量。利用edgeR軟件(Robinsonetal., 2010)篩選AmCK1vsAmT1和AmCK2vsAmT2比較組的顯著性DEmRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2fold change|≥1且P≤0.05。

利用OmicShare云平臺(tái)(www.omicshare.com)的GO分析軟件和KEGG通路分析軟件對(duì)1.4節(jié)的靶mRNA和上述靶DEmRNA進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)(George, 2008)和KEGG(Kanehisa and Goto, 2006)通路注釋?zhuān)捎媚J(rèn)參數(shù)。

1.6 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA與意大利蜜蜂工蜂中腸DEmRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

根據(jù)1.4和1.5節(jié)預(yù)測(cè)出的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA與意大利蜜蜂工蜂中腸顯著性DEmRNA的靶向關(guān)系，構(gòu)建NcCKvsNcT1比較組中DEmiRNA與AmCK1vsAmT1比較組中DEmRNA以及NcCKvsNcT2比較組中DEmiRNA與AmCK2vsAmT2比較組中DEmRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape軟件(Smootetal., 2011)進(jìn)行可視化，采用默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)DEmiRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA和DEmRNA的預(yù)測(cè)及分析

NcCKvsNcT1比較組中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的165條顯著性DEmiRNA整體上可靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的11 711條mRNA，其中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的91條顯著上調(diào)和55條顯著下調(diào)miRNA分別靶向意大利蜜蜂工蜂中腸AmCK1vsAmT1的9 920和8 391條mRNA，其余19條DEmiRNA與意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA之間無(wú)靶向關(guān)系。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的77條顯著上調(diào)miRNA和52條顯著下調(diào)miRNA可分別靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的118條顯著下調(diào)mRNA和135條顯著上調(diào)mRNA(圖1)。

NcCKvsNcT2比較組中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的124條顯著性DEmiRNA整體上可靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的11 295條mRNA，其中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的56條顯著上調(diào)和49條顯著下調(diào)miRNA可分別靶向AmCK2vsAmT2比較組中意大利蜜蜂工蜂中腸的8 138和9 055條mRNA，其余19條東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)DEmiRNA與意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA之間無(wú)靶向關(guān)系。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的52條顯著上調(diào)miRNA可靶向AmCK2vsAmT2中意大利蜜蜂工蜂中腸的97條顯著下調(diào)mRNA，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的49條顯著下調(diào)miRNA可靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的210條顯著上調(diào)mRNA(圖2)。

圖1 NcCK vs NcT1比較組中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著性DEmiRNA與AmCK1 vs AmT1比較組中意大利蜜蜂工蜂中腸的顯著性DEmRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖2 NcCK vs NcT2比較組中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著性DEmiRNA與AmCK2 vs AmT2比較組中意大利蜜蜂工蜂中腸的顯著性DEmRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NcCKvsNcT1和NcCKvsNcT2中的11條共有的顯著上調(diào)miRNA(miR-3968-y, miR-5119-y和miR-317-y等)可靶向AmCK1vsAmT1和AmCK2vsAmT2中的6條皆顯著下調(diào)的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006564187.2, XM_006567501.2和XM_006558063.2等)；19條共有的顯著下調(diào)miRNA(novel-m0016-3p, let-7-x和miR-122-x等)靶向AmCK1vsAmT1和AmCK2vsAmT2中14條皆顯著上調(diào)的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016912123.1, XM_006558673.2和XM_016916036.1等)。

NcCKvsNcT1中共63條特有的DEmiRNA，其中36條顯著上調(diào)miRNA和18條顯著下調(diào)miRNA可分別靶向AmCK1vsAmT1中的97條顯著下調(diào)mRNA和91條顯著上調(diào)mRNA，其余9條東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)DEmiRNA與意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA之間不存在靶向關(guān)系。NcCKvsNcT2中共22條特有的DEmiRNA，其中8條顯著上調(diào)miRNA和14條顯著下調(diào)miRNA可分別靶向AmCK2vsAmT2中51條顯著下調(diào)mRNA和139條顯著上調(diào)mRNA。

2.2 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸顯著性DEmRNA的GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

NcCKvsNcT1中的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK1vsAmT1中意大利蜜蜂工蜂中腸的顯著下調(diào)mRNA涉及細(xì)胞(25條下調(diào)mRNA)、細(xì)胞組分(25條下調(diào)mRNA)和細(xì)胞膜(24條下調(diào)mRNA)等10個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，細(xì)胞進(jìn)程(75條下調(diào)mRNA)、代謝進(jìn)程(60條下調(diào)mRNA)和單一組織進(jìn)程(49條下調(diào)mRNA)等15個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，以及結(jié)合(59條下調(diào)mRNA)、催化活性(55條下調(diào)mRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性(11條下調(diào)mRNA)等6個(gè)分子功能相關(guān)條目(圖3: A)。東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著下調(diào)miRNA靶向的意大利蜜蜂工蜂中腸顯著上調(diào)mRNA涉及細(xì)胞膜(15條上調(diào)mRNA)、細(xì)胞膜組分(15條上調(diào)mRNA)和細(xì)胞(12條上調(diào)mRNA)等7個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，細(xì)胞進(jìn)程(34條上調(diào)mRNA)、代謝進(jìn)程(30條上調(diào)mRNA)和單一組織進(jìn)程(21條上調(diào)mRNA)等10個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，以及結(jié)合(34條上調(diào)mRNA)、催化活性(24條上調(diào)mRNA)和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(5條上調(diào)mRNA)等8個(gè)分子功能相關(guān)條目(圖3: B)。

圖3 NcCK vs NcT1比較組中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA靶向AmCK1 vs AmT1比較組中意大利蜜蜂工蜂中腸顯著性DEmRNA的GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

NcCKvsNcT2中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK2vsAmT2中意大利蜜蜂工蜂中腸的顯著下調(diào)mRNA涉及細(xì)胞膜組分(20條下調(diào)mRNA)、細(xì)胞膜(20條下調(diào)mRNA)和細(xì)胞(14條下調(diào)mRNA)等11個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，細(xì)胞進(jìn)程(52條下調(diào)mRNA)、代謝進(jìn)程(42條下調(diào)mRNA)和單一組織進(jìn)程(35條下調(diào)mRNA)等10個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，以及結(jié)合(49條下調(diào)mRNA)、催化活性(41條下調(diào)mRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性(9條下調(diào)mRNA)等6個(gè)分子功能相關(guān)條目(圖4: A)。東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著下調(diào)miRNA靶向的意大利蜜蜂工蜂中腸顯著上調(diào)mRNA涉及細(xì)胞(24條上調(diào)mRNA)、細(xì)胞組分(24條上調(diào)mRNA)和細(xì)胞膜組分(22條上調(diào)mRNA)等9個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，細(xì)胞進(jìn)程(59條上調(diào)mRNA)、代謝進(jìn)程(47條上調(diào)mRNA)和單一組織進(jìn)程(42條上調(diào)mRNA)等12個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，以及結(jié)合(57條上調(diào)mRNA)、催化活性(35條上調(diào)mRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性(14條上調(diào)mRNA)等9個(gè)分子功能相關(guān)條目(圖4: B)。

此外，NcCKvsNcT1和NcCKvsNcT2中共同的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK1vsAmT1和AmCK2vsAmT2中共同的顯著下調(diào)mRNA可注釋到單一組織進(jìn)程(2條下調(diào)mRNA)、細(xì)胞進(jìn)程(2條下調(diào)mRNA)和結(jié)合(2條下調(diào)mRNA)等7個(gè)條目；NcCKvsNcT1和NcCKvsNcT2中共同的顯著下調(diào)miRNA靶向AmCK1vsAmT1和AmCK2vsAmT2中共同的顯著上調(diào)mRNA可注釋到結(jié)合(3條上調(diào)mRNA)、代謝進(jìn)程(2條上調(diào)mRNA)和細(xì)胞(2條上調(diào)mRNA)等10個(gè)條目。

NcCKvsNcT1中特有的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK1vsAmT1中顯著下調(diào)mRNA涉及26個(gè)條目，包括細(xì)胞膜組分(9條下調(diào)mRNA)、細(xì)胞膜(9條下調(diào)mRNA)和細(xì)胞(8條下調(diào)mRNA)等7個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，細(xì)胞進(jìn)程(27條下調(diào)mRNA)、單一組織進(jìn)程(21條下調(diào)mRNA)和代謝進(jìn)程(21條下調(diào)mRNA)等13個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，結(jié)合(24條下調(diào)mRNA)、催化活性(19條下調(diào)mRNA)、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(5條下調(diào)mRNA)等6個(gè)分子功能相關(guān)的條目。NcCKvsNcT1特有的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著下調(diào)miRNA靶向AmCK1vsAmT1中顯著上調(diào)mRNA涉及22個(gè)功能條目，包括9個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，7個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，以及6個(gè)分子功能相關(guān)條目。NcCKvsNcT2中特有的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK2vsAmT2中顯著下調(diào)mRNA可注釋到22個(gè)功能條目，包括細(xì)胞(10條下調(diào)mRNA)、細(xì)胞組分(10條下調(diào)mRNA)和細(xì)胞器(9條下調(diào)mRNA)等7個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，細(xì)胞進(jìn)程(19條下調(diào)mRNA)、代謝進(jìn)程(16條下調(diào)mRNA)和單一組織進(jìn)程(10條下調(diào)mRNA)等8個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，結(jié)合(24條下調(diào)mRNA)、催化活性(13條下調(diào)mRNA)和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(4條下調(diào)mRNA)等7個(gè)分子功能相關(guān)條目；NcCKvsNcT2中特有的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著下調(diào)miRNA靶向AmCK2vsAmT2中意大利蜜蜂工蜂顯著上調(diào)mRNA涉及28個(gè)功能條目，包括9個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，11個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，以及8個(gè)分子功能相關(guān)條目。

2.3 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸顯著性DEmRNA的KEGG通路注釋

NcCKvsNcT1中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK1vsAmT1中意大利蜜蜂工蜂中腸的顯著下調(diào)mRNA可注釋到剪接體(4條下調(diào)mRNA)、光傳導(dǎo)-果蠅(3條下調(diào)mRNA)和磷酸肌醇代謝(3條下調(diào)mRNA)等113條通路，其中包括胞吞作用(2條下調(diào)mRNA)等細(xì)胞免疫通路，以及泛素介導(dǎo)的蛋白水解(2條下調(diào)mRNA)、黑色素生成(3條下調(diào)mRNA)等體液免疫通路(圖5: A)。NcCKvsNcT1中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著下調(diào)miRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的顯著上調(diào)mRNA可注釋到Hedgehog信號(hào)通路-果蠅(3條上調(diào)mRNA)、粘著斑(3條上調(diào)mRNA)和生理節(jié)律-果蠅(2條上調(diào)mRNA)等107條通路，其中包括胞吞作用(4條上調(diào)mRNA)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解(1條上調(diào)mRNA)等細(xì)胞免疫通路，黑色素生成(1條上調(diào)mRNA)等體液免疫通路，以及色氨酸代謝(1條上調(diào)mRNA)等3條氨基酸代謝通路，檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))(2條上調(diào)mRNA)等4條碳水化合物代謝通路和氧化磷酸化(1條上調(diào)mRNA)等2條能量代謝通路(圖5: B)。注釋數(shù)量前20位的通路信息詳見(jiàn)圖5。

圖5 NcCK vs NcT1比較組中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA靶向AmCK1 vs AmT1比較組中意大利蜜蜂工蜂中腸顯著性DEmRNA注釋的前20位KEGG通路

NcCKvsNcT2中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK2vsAmT2中意大利蜜蜂工蜂中腸的顯著下調(diào)mRNA涉及代謝通路(11條下調(diào)mRNA)、鞘脂信號(hào)通路(5條下調(diào)mRNA)及硫代謝(1條下調(diào)mRNA)等97條通路，其中包括溶酶體(1條下調(diào)mRNA)、黑色素生成(1條下調(diào)mRNA)、胞吞作用(1條下調(diào)mRNA)等細(xì)胞免疫通路。NcCKvsNcT2中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著下調(diào)miRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的顯著上調(diào)mRNA涉及代謝通路(9條上調(diào)mRNA)、Hippo信號(hào)通路(5條上調(diào)mRNA)和其他聚糖降解(4條上調(diào)mRNA)等127條通路，其中包括溶酶體(4條上調(diào)mRNA)、胞吞作用(2條上調(diào)mRNA)等細(xì)胞免疫通路，以及Toll/Imd信號(hào)通路(1條上調(diào)mRNA)、Toll樣受體信號(hào)通路(1條上調(diào)mRNA)等體液免疫通路，嘧啶代謝(1條上調(diào)mRNA)等2條核苷酸代謝通路，角質(zhì)、亞黃素和蠟的生物合成(1條上調(diào)mRNA)等3條脂質(zhì)代謝通路，谷胱甘肽代謝(1條上調(diào)mRNA)等2條其他氨基酸的代謝通路，1條萜類(lèi)和聚酮類(lèi)化合物的代謝通路。注釋數(shù)量前20位的通路信息詳見(jiàn)圖6。

圖6 NcCK vs NcT2比較組中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA靶向AmCK2 vs AmT2比較組中意大利蜜蜂工蜂中腸顯著性DEmRNA注釋的前20位KEGG通路

此外，NcCKvsNcT1和NcCKvsNcT2中共同的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK1vsAmT1和AmCK2vsAmT2中共同的顯著下調(diào)mRNA未注釋到任何通路；共同的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著下調(diào)miRNA靶向共同的意大利蜜蜂工蜂中腸顯著上調(diào)mRNA可注釋到9條通路，包括生理節(jié)律(1條上調(diào)mRNA)、生理節(jié)律-果蠅(1條上調(diào)mRNA)、Hippo信號(hào)通路-多物種(1條上調(diào)mRNA)、Hedgehog信號(hào)通路(1條上調(diào)mRNA)、Hedgehog信號(hào)通路-果蠅(1條上調(diào)mRNA)、FoxO信號(hào)通路(1條上調(diào)mRNA)、Hippo信號(hào)通路(1條上調(diào)mRNA)、Hippo信號(hào)通路-果蠅(1條上調(diào)mRNA)和Wnt信號(hào)通路(1條上調(diào)mRNA)等。

NcCKvsNcT1中特有的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK1vsAmT1中特有的顯著下調(diào)mRNA涉及代謝途徑(5條下調(diào)mRNA)、剪接體(4條下調(diào)mRNA)和光傳導(dǎo)-果蠅(3條下調(diào)mRNA)等106條通路。NcCKvsNcT1東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)特有的顯著下調(diào)miRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸特有的顯著上調(diào)mRNA涉及代謝途徑(4條上調(diào)mRNA)、Hippo信號(hào)通路(3條上調(diào)mRNA)和生理節(jié)律-果蠅(2條上調(diào)mRNA)等92條通路。

NcCKvsNcT2中特有的顯著上調(diào)miRNA靶向AmCK2vsAmT2中顯著下調(diào)mRNA涉及代謝通路(5條下調(diào)mRNA)、糖胺聚糖降解(1條下調(diào)mRNA)及Notch信號(hào)通路(1條下調(diào)mRNA)等36條通路。NcCKvsNcT2中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)特有的顯著下調(diào)miRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸特有的顯著上調(diào)mRNA涉及各種類(lèi)型的N-聚糖的生物合成(4條上調(diào)mRNA)、溶酶體(4條上調(diào)mRNA)及cAMP信號(hào)通路(4條上調(diào)mRNA)等112條通路。

2.4 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA及其靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的免疫防御相關(guān)DEmRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)2.3節(jié)通路注釋的結(jié)果，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸DEmRNA涉及的免疫防御相關(guān)通路包括：胞吞作用、黑色素生成、溶酶體、自噬、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、Ras信號(hào)通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解和MAPK信號(hào)通路。

圖7 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著性DEmiRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸免疫防御和能量代謝相關(guān)通路注釋的顯著性DEmRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

NcCKvsNcT1中顯著上調(diào)的miR-14-y [log2(fold change)=16.41,P=3.76E-05]靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_395448.6) [log2(fold change)=-10.02,P=0.0076]； miR-283-x [log2(fold change)=5.50,P=0.049]和miR-216-x [log2(fold change)=16.33,P=1.43E-07]共同靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的E3泛素蛋白連接酶Nedd-4亞型X8編碼基因的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016917135.1) [log2(fold change)=-10.57,P=0.0020]。NcCKvsNcT1中顯著下調(diào)的miR-181-x[log2(fold change)=-2.22,P=0.0051]和miR-128-y[log2(fold change)=-1.87,P=5.55E-04]共同靶向的意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016915020.1) [log2(fold change)=1.04,P=0.019], miR-340-x[log2(fold change)=-1.12,P=0.024]靶向的mRNA(GenBank登錄號(hào): XM_006570195.2)[log2(fold change)=9.52,P=0.043], miR-484-z[log2(fold change)=-1.64,P=0.029]靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006571076.2)[log2(fold change)=9.40,P=0.033]和miR-320-y[log2(fold change)=-4.73,P=1.18E-04]靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_394836.6) [log2(fold change)=4.01,P=0.0086]均可注釋到胞吞作用(圖7: A)。顯著上調(diào)的miR-3202-x[log2(fold change)=12.47,P=1.75E-07], miR-317-y[log2(fold change)=19.06,P=1.72E-06]和miR-252-x[log2(fold change)=14.99,P=9.90E-05]等6條東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)DEmiRNA共同靶向的意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016911563.1) [log2(fold change)=-8.28,P=0.0093]， miR-283-x, miR-8-y [log2(fold change)=7.03,P=0.032]和miR-216-x等7條DEmiRNA共同靶向的1-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶I類(lèi)和II類(lèi)亞型X1編碼基因mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_003250942.3) [log2(fold change)=-3.41,P=0.0084]，miR-339-y [log2(fold change)=12.47,P=1.75E-07], miR-9226-y [log2(fold change)=21.32,P=1.98E-10]和miR-317-y 4條DEmiRNA共同靶向mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006559228.1) [log2(fold change)=-2.45,P=0.045]以及顯著下調(diào)的novel-m0016-3p [log2(fold change)=-7.07,P=1.82E-05]和novel-m0028-5p [log2(fold change)=-14.19,P=3.86E-07]共同靶向mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006567354.2) [log2(fold change)=2.08,P=9.21E-04]均可注釋到黑色素生成(圖7: A)。顯著上調(diào)的miR-14-y靶向的意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_395448.6) [log2(fold change)=-10.02,P=0.0076], miR-283-x和miR-216-x共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016917135.1)以及顯著下調(diào)的miR-106-x [log2(fold change)=-2.30,P=0.026], miR-17-x [log2(fold change)=-1.26,P=0.036], let-7-y [log2(fold change)=-3.76,P=0.0070], miR-20-x [log2(fold change)=-3.70,P=9.29E-04)和miR-146-x [log2(fold change)=-2.86,P=0.037)共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006564220.2) [log2(fold change)=10.41,P=0.010]均可注釋到泛素介導(dǎo)的蛋白水解(圖7: A)。顯著上調(diào)的miR-283-x, miR-216-x和miR-4796-y [log2(fold change)=15.51,P=1.21E-06]共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016914371.1)，顯著下調(diào)的miR-126-y [log2(fold change)=-3.77,P=0.0098]和miR-128-y共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_394432.6) [log2(fold change)=7.97,P=0.035]均可注釋到MAPK信號(hào)通路(圖7: A)。

在NcCKvsNcT2中，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著下調(diào)的novel-m0016-3p [log2(fold change)=-4.37,P=3.24E-04]靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016917619.1) [log2(fold change)=12.12,P=4.14E-05]和miR-320-y [log2(fold change)=-4.87,P=0.0016]靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006572368.2) [log2(fold change)=8.59,P=0.0041]以及顯著上調(diào)的miR-5106-y [log2(fold change)=19.69,P=9.27E-09]靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006561133.2)[log2(fold change)=-1.13,P=0.045]皆可注釋到胞吞作用(圖7: B)。顯著下調(diào)的novel-m0021-5p [log2(fold change)=-1.52,P=0.036]靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的4條mRNAs (GenBank登錄號(hào): XM_006567428.2) [log2(fold change)=1.52,P=0.0042]，(GenBank登錄號(hào): XM_006567431.2) [log2(fold change)=1.34,P=0.039]，(GenBank登錄號(hào): XM_016914010.1) [log2(fold change)=1.22,P=1.47E-04]和(GenBank登錄號(hào): XM_016914011.1) [log2(fold change)=3.09,P=0.042]以及顯著上調(diào)的novel-m0022-5p [log2(fold change)=14.13,P=7.97E-06]和miR-216-x [log2(fold change)=16.33,P=1.43E-07]共同靶向的類(lèi)α-乙酰氨基葡萄糖苷酶編碼基因mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016913157.1) [log2(fold change)=-9.33,P=0.010]皆可注釋到溶酶體(圖7: B)。顯著下調(diào)的novel-m0002-3p [log2(fold change)=-5.85,P=6.42E-05], novel-m0021-5p和miR-374-x[log2(fold change)=-15.48,P=1.23E-07]共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016911751.1) [log2(fold change)=1.65,P=0.0040]以及miR-26-x [log2(fold change)=-1.81,P=0.012]和miR-486-x [log2(fold change)=-8.86,P=0.028]共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006557238.2) [log2(fold change)=3.73,P=0.0047]皆可注釋到自噬-動(dòng)物(圖7: B)。顯著上調(diào)的bantam-y [log2(fold change)=16.57,P=1.84E-06], miR-8-y [log2(fold change)=5.53,P=0.044], miR-216-x和miR-5119-y [log2(fold change)=9.19,P=0.022]共同靶向的1-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶I類(lèi)和II類(lèi)亞型X3編碼基因mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006567225.2) [log2(fold change)=-8.75,P=0.016]可注釋到黑色素生成(圖7: B)。miR-424-x [log2(fold change)=13.86,P=9.14E-06], miR-7465-x [log2(fold change)=15.36,P=4.75E-07]和miR-547-x [log2(fold change)=13.98,P=5.96E-08]共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006564132.2) [log2(fold change)=-8.92,P=0.038]可注釋到MAPK信號(hào)通路-果蠅。顯著下調(diào)的miR-26-x和miR-486-x共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006557238.2)可同時(shí)注釋到細(xì)胞凋亡、MAPK信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路(圖7: B)。顯著上調(diào)的miR-5106-y靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006561133.2),顯著下調(diào)的miR-26-x和miR-486-x共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006557238.2), novel-m0021-5p, miR-221-z [log2(fold change)=-2.89,P=0.0039], miR-374-x, miR-423-y [log2(fold change)=-2.04,P=0.012], miR-17-x [log2(fold change)=-1.92,P=0.039]和miR-16-y [log2(fold change)=-16.85,P=5.38E-08]共同靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006569471.2) [log2(fold change)=5.64,P=0.027]以及顯著上調(diào)的miR-8-y, bantam-y和novel-m0022-5p [log2(fold change)=14.13,P=7.97E-06]等10條miRNA共同靶向的1-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶ε-1編碼基因mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_016911813.1) [log2(fold change)=-7.89，P=0.023]皆可注釋到Ras信號(hào)通路(圖7: B)。

此外，根據(jù)2.3節(jié)通路注釋的結(jié)果，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)顯著性DEmiRNA靶向的意大利蜜蜂工蜂中腸DEmRNA可注釋到氧化磷酸化和硫代謝等能量代謝相關(guān)通路。NcCKvsNcT1中顯著下調(diào)的miR-584-x [log2(fold change)=-1.32,P=0.042]和miR-151-y [log2(fold change)=-2.21,P=6.92E-04]等2條miRNA共同靶向的細(xì)胞色素c氧化酶亞基4亞型X1，線粒體亞型X1編碼基因mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006572254.2) [log2(fold change)=-2.21,P=6.92E-04],顯著上調(diào)的miR-459-x[log2(fold change)=16.24,P=1.76E-07], miR-315-x[log2(fold change)=12.80,P=4.70E-06]和miR-5119-y分別靶向的mRNAs (GenBank登錄號(hào): XM_001122063.4)[log2(fold change)=-1.07,P=0.022]、(GenBank登錄號(hào): XM_006567193.2)[log2(fold change)=-1.02,P=8.31E-04]和(GenBank登錄號(hào): XM_623229.5) [log2(fold change)=-2.86,P=0.0095]皆可注釋到氧化磷酸化(圖7: C)。NcCKvsNcT2中顯著上調(diào)的miR-301-y [log2(fold change)=15.58,P=6.07E-09]靶向的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_396499.6) [log2(fold change)=-2.09,P=0.0048]可注釋到硫代謝(圖7: D)。

NcCKvsNcT1中特有的miR-186-x [log2(fold change)=1.02,P=0.047767213]靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的mRNAs (GenBank登錄號(hào): XM_006559228.1)和(GenBank登錄號(hào): NM_001011611.2) [log2(fold change)=-4.44,P=0.0048]可分別注釋到黑色素生成通路和免疫系統(tǒng)進(jìn)程條目，NcCKvsNcT2中特有的novel-m0022-5p靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006559395.1) [log2(fold change)=-1.23,P=0.0088], mRNA(GenBank登錄號(hào): XM_006560586.2) [log2(fold change)=-1.13,P=1.03E-07]和mRNA(GenBank登錄號(hào): XM_016911813.1)可注釋到代謝途徑。

NcCKvsNcT1中特有的miR-22-x [log2(fold change)=-13.99,P=6.33E-06]靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的mRNAs (GenBank登錄號(hào): XM_006563625.2) [log2(fold change)=8.42,P=0.027]和(GenBank登錄號(hào): XM_006559419.2) [log2(fold change)=1.30,P=0.0078]可分別注釋到生物附著和應(yīng)激反應(yīng)條目。NcCKvsNcT2中特有的miR-26-x靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006557238.2)可同時(shí)注釋到Toll樣受體信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路及生物進(jìn)程調(diào)節(jié)功能條目。

3 討論

3.1 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)DEmiRNA對(duì)意大利蜜蜂工蜂中腸的基因表達(dá)具有潛在的廣泛影響

本研究中，NcCKvsNcT1中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著下調(diào)miRNA靶向的意大利蜜蜂工蜂中腸顯著上調(diào)mRNA涉及7個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，10個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，8個(gè)分子功能相關(guān)條目(圖3: B)；以及3條氨基酸代謝通路，4條碳水化合物代謝通路，2條能量代謝通路(圖5: B)。NcCKvsNcT2中東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的顯著下調(diào)miRNA靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的顯著上調(diào)mRNA涉及9個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，12個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，9個(gè)分子功能相關(guān)條目(圖4: B)；以及2條核苷酸代謝通路，3條脂質(zhì)代謝通路，2條其他氨基酸的代謝通路，1條萜類(lèi)和聚酮類(lèi)化合物的代謝通路(圖6: B)。這些結(jié)果暗示東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在侵染意大利蜜蜂工蜂中腸的不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)差異表達(dá)部分miRNA對(duì)相應(yīng)的意大利蜜蜂工蜂基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響上述與意大利蜜蜂工蜂物質(zhì)和能量代謝相關(guān)的多個(gè)方面。

此外，NcCKvsNcT1和NcCKvsNcT2比較組共同的顯著下調(diào)miRNA靶向AmCK1vsAmT1和AmCK2vsAmT2比較組共同的顯著上調(diào)mRNA可注釋到10個(gè)GO條目，以及9條KEGG通路。上述結(jié)果表明東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在侵染意大利蜜蜂工蜂中腸的過(guò)程中可能通過(guò)持續(xù)差異表達(dá)一些miRNA對(duì)宿主的細(xì)胞活動(dòng)、生化反應(yīng)、生理活動(dòng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的影響。

3.2 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)可能通過(guò)下調(diào)表達(dá)部分miRNA對(duì)意大利蜜蜂工蜂中腸的能量代謝進(jìn)行調(diào)控

在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的基因組大大簡(jiǎn)化，多數(shù)物質(zhì)和能量代謝的途徑丟失，其增殖高度依賴宿主細(xì)胞提供物質(zhì)和能量(Burrietal., 2006)。Chen等(2013)研究發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染可對(duì)西方蜜蜂工蜂造成較強(qiáng)的能量脅迫，致使宿主的能量代謝速率加快且糖水的攝入量提高。ATP/ADP轉(zhuǎn)移酶和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與微孢子蟲(chóng)對(duì)宿主物質(zhì)和能量的竊取(Paldietal., 2010)。前期研究中，筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的7個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因在NcCKvsNcT1和NcCKvsNcT2中差異表達(dá)(耿四海等, 2020b)。本研究發(fā)現(xiàn)，NcCKvsNcT1中miR-151-y和miR-584-x顯著下調(diào)表達(dá)，且能靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006572254.2)，該基因可注釋到能量代謝相關(guān)的氧化磷酸化信號(hào)通路。上述結(jié)果暗示東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的DEmiRNA參與意大利蜜蜂工蜂中腸的關(guān)鍵能量代謝過(guò)程，控制宿主能量代謝增強(qiáng)以產(chǎn)生更多的ATP，從而掠奪更多的ATP利于自身增殖。

3.3 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)可能通過(guò)上調(diào)表達(dá)部分miRNA調(diào)控意大利蜜蜂工蜂中腸的免疫防御

昆蟲(chóng)的天然免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫，前者主要是指東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)體被血淋巴細(xì)胞等識(shí)別、包被和吞噬，而后者主要包括各種識(shí)別受體、胞內(nèi)信號(hào)因子、抗微生物肽、蛋白酶以及酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致血淋巴凝結(jié)、黑化等(Leulieretal., 2000)。較多的研究證明，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在侵染宿主的過(guò)程中可通過(guò)多種方式跨界調(diào)控宿主的基因表達(dá)，并抑制宿主免疫防御(Wangetal., 2017; Shahidetal., 2018; Cuietal., 2019; Huangetal., 2019)。菟絲子將Bc-siR3.2裝載到AGO1蛋白，靶向擬南芥Arabidopsisthaliana的絲裂原活化蛋白激酶2基因(MPK2)和MPK1基因的轉(zhuǎn)錄本，從而抑制宿主的免疫反應(yīng)(Shahidetal., 2018)。球孢白僵菌將bba-milR-1載入囊泡并轉(zhuǎn)運(yùn)到斯氏按蚊Anophelesstephensi的細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而跨界調(diào)控宿主基因CLIPB9和Spz4的表達(dá)，抑制Toll樣受體信號(hào)通路和逃避黑化反應(yīng)(Cuietal., 2019)。本研究發(fā)現(xiàn)，NcCKvsNcT1和NcCKvsNcT2比較組中miR-216-x, miR-8-y, miR-4796-y, bantam-y和miR-5119-y等多個(gè)共同顯著上調(diào)的miRNA可靶向注釋到黑色素生成、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解和溶酶體等通路的多條顯著下調(diào)mRNA。其中，NcCKvsNcT1中的miR-216-x同時(shí)靶向AmCK1vsAmT1中可注釋到宿主免疫相關(guān)的黑色素生成、MAPK信號(hào)通路及泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路的mRNAs (GenBank登錄號(hào)分別為XM_003250942.3, XM_016914371.1和XM_016917135.1)(圖7: A)；NcCKvsNcT2中的miR-216-x還可同時(shí)靶向AmCK2vsAmT2中可注釋到意大利蜜蜂工蜂免疫相關(guān)的黑色素生成、溶酶體及Ras信號(hào)通路通路的mRNAs (GenBank登錄號(hào)分別為XM_006567225.2, XM_016913157.1和XM_016911813.1)(圖7: B)。NcCKvsNcT1中miR-8-y靶向AmCK1vsAmT1中的mRNA可注釋到黑色素生成通路(圖7: A)；NcCKvsNcT2中miR-8-y靶向AmCK2vsAmT2中的2個(gè)mRNA可分別注釋到黑色素生成和Ras信號(hào)通路(圖7: B)。NcCKvsNcT1中miR-4796-y靶向AmCK1vsAmT1中的mRNA可注釋到MAPK信號(hào)通路(圖7: A)；NcCKvsNcT2中miR-4796-y靶向AmCK2vsAmT2中的mRNA可注釋到Ras信號(hào)通路(圖7: B)。NcCKvsNcT1中bantam-y靶向AmCK1vsAmT1中的mRNA可注釋到黑色素生成(圖7: A)；NcCKvsNcT2中bantam-y同時(shí)靶向AmCK2vsAmT2中2條mRNA可分別注釋到Ras信號(hào)通路和黑色素生成(圖7: B)。NcCKvsNcT1中miR-5119-y靶向AmCK1vsAmT1中的mRNA可注釋到黑色素生成(圖7: A)；NcCKvsNcT2中miR-5119-y還同時(shí)靶向AmCK2vsAmT2中的2條mRNA可分別注釋到黑色素生成和MAPK信號(hào)通路(圖7: B)。

值得注意的是，筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NcCKvsNcT2中bantam-y可靶向東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的己糖激酶編碼基因mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_002995838.1)，該基因可注釋到東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)能量代謝相關(guān)的糖酵解/糖異生途徑；并且bantam-y和miR-5119-y可分別靶向東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)自身的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因mRNA (GenBank登錄號(hào)分別為XM_002995835.1和XM_002996675.1)(耿四海等, 2020a)。據(jù)此猜測(cè)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在侵染意大利蜜蜂工蜂中腸的過(guò)程中通過(guò)不同程度地差異表達(dá)miR-216-x和miR-8-y等miRNA對(duì)意大利蜜蜂工蜂中腸的黑色素生成、溶酶體和Ras信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，此外東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)還能通過(guò)差異表達(dá)bantam-y和miR-5119-y等miRNA一方面調(diào)控意大利蜜蜂工蜂中腸的黑色素生成、Ras信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路，另一方面調(diào)節(jié)自身的物質(zhì)和能量運(yùn)輸，從而促進(jìn)增殖，體現(xiàn)了miRNA作為具有多面性的關(guān)鍵調(diào)控因子在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和意大利蜜蜂工蜂中腸的互作中扮演著特殊角色。

3.4 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在不同侵染時(shí)間點(diǎn)通過(guò)特異性差異表達(dá)部分miRNA對(duì)意大利蜜蜂工蜂中腸基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控

NcCKvsNcT1中特有的miR-186-x靶向意大利蜜蜂工蜂中腸的mRNAs (GenBank登錄號(hào)分別為XM_006559228.1和NM_001011611.2)可分別注釋到黑色素生成通路和免疫系統(tǒng)進(jìn)程條目，NcCKvsNcT2中特有的novel-m0022-5p靶向意大利蜜蜂工蜂可注釋到代謝途徑的mRNAs (GenBank登錄號(hào)分別為XM_006559395.1, XM_006560586.2和XM_016911813.1)。我們推測(cè)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在感染意大利蜜蜂工蜂7 d通過(guò)上調(diào)miR-186-x抑制意大利蜜蜂工蜂中腸的免疫防御相關(guān)基因的表達(dá)，在感染10 d時(shí)通過(guò)上調(diào)novel-m0022-5p對(duì)意大利蜜蜂工蜂中腸的能量代謝相關(guān)基因進(jìn)行抑制，從而加強(qiáng)對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)能量的掠奪，供其增殖所需。此外，NcCKvsNcT1中特有的miR-22-x靶向意大利蜜蜂工蜂可分別注釋到生物附著和應(yīng)激反應(yīng)條目的mRNAs (GenBank登錄號(hào)分別為XM_006563625.2和XM_006559419.2)，NcCKvsNcT2中特有的miR-26-x靶向意大利蜜蜂工蜂的mRNA (GenBank登錄號(hào): XM_006557238.2)可同時(shí)注釋到Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路及生物進(jìn)程調(diào)節(jié)功能條目。這些結(jié)果表明東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)在感染意大利蜜蜂工蜂7 d和10 d可能通過(guò)分別下調(diào)miR-22-x和miR-26-x對(duì)上述重要的功能條目和通路相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行抑制，從而影響宿主的正常生命活動(dòng)。

綜上所述，本研究結(jié)合前期獲得的高質(zhì)量miRNA和mRNA組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)DEmiRNA靶向的意大利蜜蜂工蜂中腸mRNA和DEmRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)、分析和探討，揭示病原的DEmiRNA對(duì)宿主的基因表達(dá)調(diào)控具有廣泛性，病原可能通過(guò)上調(diào)部分miRNA調(diào)控宿主的免疫防御以促進(jìn)增殖，通過(guò)下調(diào)部分miRNA跨界調(diào)控宿主的能量代謝以加強(qiáng)能量竊取并促進(jìn)增殖。研究結(jié)果為闡明東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)跨界調(diào)控意大利蜜蜂工蜂中腸的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為深入理解二者的互作機(jī)制提供了有價(jià)值的參考信息。