彭 竹, 黃 麗, 趙淑果, 呂建華, 趙慧婷

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太谷 030801)

昆蟲(chóng)具有靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)，能夠通過(guò)識(shí)別環(huán)境中的氣味分子來(lái)進(jìn)行覓食、交配、躲避敵害以及尋找棲息地等一系列行為。例如，小菜蛾P(guān)lutellaxylostella能夠根據(jù)芥菜油異硫氰酸酯的含量來(lái)識(shí)別十字花科伯內(nèi)特家族的成員(Verkerk and Wright, 2008)。觸角是昆蟲(chóng)感受外界環(huán)境氣味分子，嗅覺(jué)發(fā)生的主要器官。在昆蟲(chóng)觸角外周嗅覺(jué)系統(tǒng)中參與化學(xué)感知過(guò)程的蛋白主要包括氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、嗅覺(jué)受體(olfactory receptors, ORs)、離子型受體(ionotropic receptors, IRs)、感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和氣味降解酶(odorant-degrading enzymes, ODEs)(Sánchez-Graciaetal., 2009; Leal, 2013)。其中，OBPs是昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別中的關(guān)鍵蛋白。昆蟲(chóng)OBP于1981年在雄性多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus的觸角中首次被發(fā)現(xiàn)(Vogt and Riddiford, 1981)，目前OBPs已在鱗翅目(Sunetal., 2017a)、鞘翅目(Lietal., 2017)、雙翅目(Zhao Yetal., 2018)、膜翅目(Zhaoetal., 2016)、直翅目(Jiangetal., 2018)和半翅目(Sunetal., 2017b)等多類昆蟲(chóng)中鑒定獲得。

OBPs是一種低分子量的水溶性球蛋白，可以通過(guò)與氣味分子形成復(fù)合物穿過(guò)淋巴液，然后與嗅覺(jué)神經(jīng)元樹(shù)突膜上的ORs相互作用，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，指導(dǎo)昆蟲(chóng)產(chǎn)生相應(yīng)的行為反應(yīng)(Pelosietal., 2018)。根據(jù)OBPs序列的保守性和功能可以分為3類：信息素結(jié)合蛋白(PBPs)、一般氣味結(jié)合蛋白(GOBPs)和觸角特異性蛋白(ASPs)(Zhou, 2010)。OBPs的構(gòu)象受到pH值的影響，與神經(jīng)元膜表面的鄰近性有關(guān)，從而介導(dǎo)揮發(fā)性分子的結(jié)合和釋放(Sandleretal., 2000; Wei and Leal, 2008)。一般來(lái)說(shuō)，在中性環(huán)境中，OBP與配體的結(jié)合親和力更高(Lietal., 2018)。此外，由于OBP體積小、可溶性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、易于操作和修飾，是更易于研究的目標(biāo)(Britoetal., 2016)。多年來(lái)，研究者們致力于在體外模仿生物體的嗅覺(jué)感知能力，以期實(shí)現(xiàn)構(gòu)建高靈敏、高特異性的嗅覺(jué)生物傳感器，拓展其在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)及疾病診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用及發(fā)展(Larisikaetal., 2015; 盧妍利, 2017)。

近年來(lái)，由于熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、便宜經(jīng)濟(jì)、結(jié)果穩(wěn)定，被廣泛應(yīng)用于研究昆蟲(chóng)OBPs與氣味物質(zhì)的結(jié)合能力(彭竹等, 2020)，如小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaOBP31(覃江梅等, 2016)、棉鈴蟲(chóng)HelicoverpaarmigeraOBP16(李兆群等, 2017)、甘薯蟻象CylasformicariusOBP8(賈小儉等, 2019)、西方蜜蜂ApismelliferaOBP14(Iovinellaetal., 2011; Spinellietal., 2012)、稻縱卷葉螟CnaphalocrocismedinalisOBP14(Sunetal., 2019)等與化合物的結(jié)合能力。

中華蜜蜂Apisceranacerana(簡(jiǎn)稱“中蜂”)是東方蜜蜂Apiscerana的指名亞種，為我國(guó)獨(dú)有的蜜蜂品種，與意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(簡(jiǎn)稱“意蜂”)同是傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的重要傳粉昆蟲(chóng)。中蜂具有飛行迅捷、嗅覺(jué)靈敏、抗逆性強(qiáng)和善于采集零星蜜粉源等優(yōu)點(diǎn)(趙慧婷等, 2015)。目前對(duì)中華蜜蜂OBPs的研究主要集中在基因的時(shí)空表達(dá)和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析上，對(duì)其重組蛋白表達(dá)及功能的報(bào)道較少。為深入研究中蜂嗅覺(jué)基因的功能，在本課題組前期測(cè)定的中華蜜蜂觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) (Zhaoetal., 2018)的基礎(chǔ)上，從中篩選出了觸角上特異性表達(dá)的氣味結(jié)合蛋白基因AcerOBP14，并對(duì)其進(jìn)行了克隆和時(shí)空表達(dá)分析(杜亞麗等, 2016)，結(jié)果顯示AcerOBP14在20日齡中蜂觸角中表達(dá)量最高。為進(jìn)一步探究AcerOBP14 在20日齡這一階段中蜂嗅覺(jué)感知中的功能，本研究選擇了中蜂采粉蜂、意蜂采粉蜂、20日齡中蜂成年工蜂及20日齡中蜂成年雄蜂的觸角樣本，分析比較了OBP14在各樣本中的表達(dá)量，測(cè)定了AcerOBP14重組蛋白與植物揮發(fā)物、信息素等氣味化合物的結(jié)合特性。該研究不僅為OBP14在中蜂和意蜂中的功能比較奠定基礎(chǔ)，也有助于深入解析OBPs在中蜂獨(dú)特的生理行為中發(fā)揮的作用，為其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

實(shí)驗(yàn)用蜜蜂均采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。選取群勢(shì)強(qiáng)壯、健康無(wú)病、無(wú)自然分蜂傾向的蜂群，從中蜂群中分別抽出成熟封蓋的工蜂子脾、雄蜂子脾置于人工培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，待其羽化出房后用無(wú)味無(wú)毒的記號(hào)筆在背部進(jìn)行標(biāo)記(約 2 000 頭)，標(biāo)記后再放回原來(lái)的蜂箱， 待20日齡時(shí)采集工蜂和雄蜂(選取的中蜂雄蜂是16∶00時(shí)左右交配返回蜂巢的，此時(shí)的雄蜂處于性成熟階段)，采集時(shí)用消毒鑷輕輕夾住蜜蜂的胸部，收集至木盒中。另外，在巢門口采集后足攜帶花粉的中蜂采粉蜂和意蜂采粉蜂。在蜜蜂巢門口，用消毒鑷輕輕夾住中蜂采粉蜂和意蜂采粉蜂胸部，收集至木盒中。每個(gè)樣本需采集蜜蜂300頭，隨機(jī)分為3組，分離觸角，每100對(duì)觸角混樣作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采集后的樣品要迅速投入盛有液氮的研缽中，速凍并研磨至粉末狀隨后置于含有 1 mL Trizol 的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 質(zhì)粒、細(xì)胞與試劑

中蜂AcerOBP14重組蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a/AcerOBP14以及大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存?？俁NA 提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；cDNA 第1 鏈合成試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和熒光定量試劑盒SYBR PremixEx TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；固相RNase清除劑、凝血酶和牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；色譜級(jí)甲醇購(gòu)自TEDIA 公司；1-NPN(N-苯基 -1-萘胺，N-phenyl-1-naphthylamine)購(gòu)自梯希愛(ài)公司(純度>97%)；氣味標(biāo)品均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

按照Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行1.1節(jié)觸角樣本總 RNA 的提取，經(jīng)純度和濃度測(cè)定之后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)合成cDNA 第1鏈，反應(yīng)所需 RNA 總量為 1 μg。獲得的 cDNA 模板置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 qRT-PCR測(cè)定基因表達(dá)量

以1.3節(jié)合成的4種觸角樣本cDNA為模板，利用在線工具 Primer3Plus(http:∥www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)設(shè)計(jì)引物序列，選擇東方蜜蜂的Arp1(GenBank登錄號(hào): HM640276.1)為內(nèi)參基因(正向引物序列：5′-ACTACGGCCGAACGTGAAAT-3′；反向引物序列：5′-GGAAAAGAGCCTCGGGACAA-3′)。 參考AcerOBP14(GenBank登錄號(hào): KT246482)設(shè)計(jì)擴(kuò)增OBP14的引物(正向引物序列：5′-GGCTTTTGCATTTGCGT TGG-3′；反向引物序列：5′-CAATGCCAGTTTCTGT GGCG-3′)。使用 SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系(15 μL): SYBR? Premix Ex TaqTMII(2×)7.5 μL, 2×ROX Reference Dye II 0.4 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL, cDNA 模板 1.5 μL, 滅菌超純水 4.4 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性 30 s; 95℃變性 5 s, 60℃退火 30 s, 共 42個(gè)循環(huán)。熔解曲線的反應(yīng)條件: 95℃ 15 s, 60℃ 1 min。以O(shè)BP14在20日齡中蜂成年工蜂觸角中的表達(dá)量為基準(zhǔn)，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

活化含重組表達(dá)載體pET28a/AcerOBP14的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后重新轉(zhuǎn)進(jìn)BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，平板涂布后，挑取獲得的單克隆菌落接種于3 mL LB 培養(yǎng)基(含Kan 30 μg/mL) 中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,活化后按1∶1 000比例(v/v)轉(zhuǎn)接至10 mL LB培養(yǎng)基(含Kan 50 μg/mL)，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8左右;取1 mL菌液作為陰性對(duì)照，再向原菌液加入IPTG至終濃度為0.5 mmol /L，轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r/min，分別于20, 28和37℃下繼續(xù)誘導(dǎo)，6 h后對(duì)電泳圖進(jìn)行分析，確定最佳誘導(dǎo)溫度。

將200 mL 誘導(dǎo)后的含pET28a/AcerOBP14的菌液，12 000 r/min離心10 min，棄上清，收集至50 mL離心管中，加入20 mL裂解緩沖液充分懸浮菌體后，間斷超聲30 min， 4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清和沉淀，確定重組蛋白的位置。沉淀經(jīng)結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl， 5 mmol/L咪唑， 0.5 mol/L NaCl， 8 mol/L尿素)重懸后，經(jīng) 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，然后用鎳柱純化目的蛋白。用不同濃度(15, 30, 50, 80, 100, 300和500 mmol/L)咪唑洗脫緩沖液對(duì)鎳柱進(jìn)行梯度洗脫，之后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，將含有目的蛋白的洗脫液轉(zhuǎn)移至透析袋中(截流量3.5 kD)，在Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)中4℃透析24 h，期間更換新鮮的Tris-HCl緩沖液3次,用超濾凝縮管(Millipore，截留分子量為 10 kD)濃縮后，用凝血酶切除 His-tag，參照His 標(biāo)簽蛋白純化說(shuō)明書再次進(jìn)行親和層析蛋白純化。將純化后的目的蛋白分裝至2 mL離心管中，置于-80℃保存。

1.6 重組蛋白濃度測(cè)定

Bradford法測(cè)定蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA用雙蒸水稀釋成7個(gè)濃度梯度(0, 24, 48, 60, 72, 84, 96和120 μg/mL)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在每孔中加入1×G250考馬斯亮藍(lán)500 μL，然后將稀釋好的 BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)品分別加入 96 孔板中，每孔 180 μL，顛倒混和數(shù)次后室溫放置10 min，在酶標(biāo)儀595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，重復(fù)測(cè)定3 次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算用于熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的重組蛋白AcerOBP14樣品的蛋白濃度。

1.7 熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選取了4種信息素和23種植物揮發(fā)物。熒光分光光度計(jì)(RF-5301PC型)為日本島津公司生產(chǎn)。具體步驟如下：設(shè)置熒光分光光度計(jì)激發(fā)光波長(zhǎng)為337 nm，掃描發(fā)射波長(zhǎng)范圍360～550 nm，狹縫寬度為3 nm，靈敏度為高。在熒光比色皿中加入1-NPN和AcerOBP14蛋白的混合液(終濃度均為1 μmol/L)，靜置2 min使充分反應(yīng)，測(cè)定熒光強(qiáng)度，然后將溶于甲醇的氣味標(biāo)樣(終濃度為1 μmol /L)依次加到熒光比色皿中，濃度從1～10 μmol/L 依次遞增，靜置2 min，待熒光強(qiáng)度穩(wěn)定后，記錄最大熒光值。

為了測(cè)定蛋白的結(jié)合濃度，以337 nm(最大發(fā)射光譜處)的熒光強(qiáng)度值對(duì)1-NPN濃度作圖。Scatchard 法線性化該曲線。假設(shè)蛋白活性為100%，并且在飽和狀態(tài)下，蛋白與氣味化合物1∶1結(jié)合，根據(jù)氣味化合物的IC50值(氣味化合物替換50%探針時(shí)的濃度)，計(jì)算氣味化合物的解離常數(shù)Ki(Ki=IC50/[I+(1-NPN)/K1-NPN])。計(jì)算公式中，1-NPN是未結(jié)合1-NPN濃度，K1-NPN為OBP/1-NPN復(fù)合物的解離常數(shù)。解離常數(shù)越小，表示蛋白與氣味化合物的結(jié)合能力越強(qiáng)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用 2-ΔΔCT的方法檢驗(yàn)OBP14在不同樣本間的表達(dá)差異，采用單因素ANOVA法進(jìn)行方差分析，Duncan氏多重比較法分析差異顯著性(P<0.01表示差異極顯著)。使用GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)qRT-PCR和熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果

2.1 OBP14在中蜂和意蜂不同觸角樣本中的表達(dá)

利用 qRT-PCR 測(cè)定了OBP14在中蜂采粉蜂、意蜂采粉蜂、20日齡中蜂成年工蜂和20日齡中蜂成年雄蜂觸角中mRNA的表達(dá)量(圖1)。結(jié)果顯示，OBP14在4種觸角樣本中均有表達(dá)，但在中蜂采粉蜂觸角中的表達(dá)量最高，其次為在20日齡中蜂成年工蜂、20日齡中蜂成年雄蜂中的，均顯著高于在意蜂采粉蜂觸角中的表達(dá)量(P<0.01)。

圖1 OBP14在中蜂和意蜂不同觸角樣本中的表達(dá)量

2.2 AcerOBP14重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

重組質(zhì)粒pET28a/AcerOBP14轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)出目的蛋白。實(shí)驗(yàn)中確定最佳誘導(dǎo)溫度為28℃，SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，通過(guò)尿素變性、純化及透析復(fù)性后用凝血酶切除 His-tag 標(biāo)簽，對(duì)切除標(biāo)簽后的蛋白再次純化，在約14 kD處出現(xiàn)預(yù)期的單一條帶(圖2: 泳道11)，條帶清晰均一，可用于熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

圖2 AcerOBP14重組蛋白 SDS-PAGE 分析

2.3 AcerOBP14重組蛋白濃度

采用Bradford蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定了去除 His-tag 標(biāo)簽AcerOBP14的濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.9916x+0.381(R2=0.9963)。經(jīng)計(jì)算， 用于熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的重組蛋白樣品AcerOBP14的濃度為 0.784 mg/mL。

2.4 AcerOBP14重組蛋白與氣味化合物的結(jié)合能力

圖3 1-NPN 與重組蛋白AcerOBP14的結(jié)合分析

通過(guò)Scachard方程對(duì)AcerOBP14與1-NPN的結(jié)合曲線進(jìn)行線性化處理，計(jì)算出該蛋白與 1-NPN的解離常數(shù)為1.087 μmol/L(圖3)。采用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定AcerOBP14重組蛋白與37種氣味化合物的結(jié)合能力，結(jié)果(圖4和表1)顯示，AcerOBP14重組蛋白可以與測(cè)試的蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多種植物揮發(fā)物結(jié)合，與植物揮發(fā)物β-羅勒烯的結(jié)合能力最強(qiáng)(解離常數(shù) Ki=0.297 μmol/L)，其次是與α-法尼烯(解離常數(shù)Ki=0.654 μmol/L)，與其他氣味化合物也有較強(qiáng)的結(jié)合能力(Ki<10 μmol/L)，與肉桂酸乙酯和香草醇幾乎沒(méi)有結(jié)合能力(Ki>50 μmol/L)，而與5種幼蟲(chóng)信息素組分(棕櫚酸甲酯、油酸乙酯、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯和亞麻酸甲酯)沒(méi)有結(jié)合能力。

圖4 部分候選配體與1-NPN 和重組蛋白AcerOBP14的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合

3 討論

本研究結(jié)果顯示，OBP14 mRNA在中蜂采粉蜂觸角中的表達(dá)量極顯著高于意大利蜜蜂采粉蜂觸角中的，推測(cè)OBP14在中蜂的嗅覺(jué)行為中發(fā)揮著更重要作用，但由于目前尚缺乏中蜂和意蜂觸角中的其他氣味結(jié)合蛋白時(shí)空表達(dá)特性的比較研究，因此有關(guān)中蜂較意蜂嗅覺(jué)更靈敏的這一認(rèn)識(shí)仍有待進(jìn)一步證實(shí)。20日齡成年工蜂，除承擔(dān)巢內(nèi)工作外，還從事采粉、采蜜、采水、采膠、守衛(wèi)等巢外工作(Graham, 2015)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中蜂采粉蜂觸角中OBP14 mRNA表達(dá)量極顯著高于20日齡中蜂成年工蜂觸角中的表達(dá)量，暗示AcerOBP14主要在識(shí)別花香氣味上發(fā)揮作用，尤其在花粉采集上具有重要作用。AcerOBP14基因在20日齡中蜂成年雄蜂觸角中也有表達(dá)，但極顯著低于在中蜂采粉蜂和20日齡中蜂成年工蜂觸角中的表達(dá)量(圖1)，進(jìn)一步推測(cè)AcerOBP14可能主要參與調(diào)控中蜂的采集行為，另外在雄蜂性信息素感知過(guò)程中也發(fā)揮作用。

表1 候選氣味化合物與 1-NPN競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合重組蛋白AcerOBP14的結(jié)合特性

通過(guò)對(duì)AcerOBP14體外原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要以包涵體的形式存在，形成包涵體可能與pET28a 表達(dá)載體本身高表達(dá)性質(zhì)有關(guān)。因?yàn)?，一方面蛋白表達(dá)量越高越容易形成包涵體，蛋白合成的速度太快，沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確地配對(duì)(吉挺等, 2014)；另一方面，原核表達(dá)系統(tǒng)中缺失促使蛋白正確折疊的各種影響因子(程小娟等, 2016)。實(shí)驗(yàn)得到的包涵體需要經(jīng)過(guò)純化、變性、復(fù)性后才能具有生理活性，目的蛋白才能用于后續(xù)功能的研究。

熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)已應(yīng)用于棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera、銅綠麗金龜Anomalacorpulenta、綠盲蝽Apolyguslucorμm、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、斑翅果蠅Drosophilasuzukii等多種昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白的結(jié)合特性分析(程小娟等, 2016; 李都等, 2019; 彭竹等, 2020)。本研究的熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， AcerOBP14能夠與蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素以及植物揮發(fā)物等多種氣味化合物結(jié)合(表1)，表明一個(gè)基因可能調(diào)控昆蟲(chóng)對(duì)多種揮發(fā)物的識(shí)別(Sunetal., 2019)。在測(cè)試的氣味化合物中，與AcerOBP14結(jié)合能力最強(qiáng)的是植物揮發(fā)物β-羅勒烯，其次是α-法尼烯。結(jié)合qRT-PCR分析結(jié)果，我們推測(cè)AcerOBP14在中華蜜蜂識(shí)別植物氣味的過(guò)程中，即在其外出采集過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。植物揮發(fā)物β-羅勒烯是蘭科石斛花朵中的重要成分，石斛花為蟲(chóng)媒花，其花香在蜂蝶類授粉中發(fā)揮著重要的作用，另外β-羅勒烯作為植物揮發(fā)物對(duì)采集蜂的采粉行為有直接影響(Maetal., 2015; 張智博等, 2018; 王元成等, 2020)。近年來(lái)，研究人員還發(fā)現(xiàn)β-羅勒烯也是一種蜜蜂幼蟲(chóng)信息素組分，能夠抑制蜜蜂工蜂的卵巢成熟，并且參與調(diào)節(jié)工蜂的采粉行為，提高采粉蜂的比例，增加哺育蜂訪問(wèn)巢房的頻率(何旭江等, 2016; 張智博等, 2018)。He等(2016)還發(fā)現(xiàn)饑餓的蜜蜂幼蟲(chóng)通過(guò)增加β-羅勒烯的產(chǎn)量向工蜂發(fā)出信號(hào)，故工蜂可以通過(guò)識(shí)別這一信息素信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)群內(nèi)的食物分配。本研究結(jié)果表明，AcerOBP14與β-羅勒烯的結(jié)合能力極強(qiáng)，因此推測(cè)其可能具有參與工蜂的采粉及監(jiān)控群內(nèi)幼蟲(chóng)進(jìn)食等行為。AcerOBP14與大部分幼蟲(chóng)信息素不能有效結(jié)合，這可能與氣味結(jié)合蛋白選擇性綁定氣味分子這一生理功能相符(顏偉玉等, 2009; Manoharanetal., 2013)。Spinelli等(2012)研究了意大利蜜蜂OBP14的氣味化合物結(jié)合特性，結(jié)果表明，AmelOBP14與丁香酚、檸檬腈的結(jié)合能力最強(qiáng)，在同其他氣味化合物的結(jié)合能力的強(qiáng)弱上，與AcerOBP14 也有差異，可以看出中蜂和意蜂在結(jié)合特性上差異較大(Iovinellaetal., 2011; Spinellietal., 2012)，推測(cè)OBP14的功能可能存在較大的種間差異。今后可以通過(guò)免疫印跡、觸角電位(electroantennogram, EAG)、行為學(xué)反應(yīng)和RNAi等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較、確證兩蜂種OBP14的功能。

本研究qRT-PCR結(jié)果表明，氣味結(jié)合蛋白OBP14基因在中蜂采粉蜂觸角中的相對(duì)表達(dá)量高于意蜂采粉蜂及中蜂20日齡成年工蜂和雄蜂觸角中的表達(dá)量。熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AcerOBP14的配體結(jié)合譜較寬，能與蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多種植物揮發(fā)物結(jié)合，其中結(jié)合能力最強(qiáng)的是β-羅勒烯，暗示AcerOBP14較大程度上參與和調(diào)控了中華蜜蜂的采粉行為。