程佑民 林靜瑜 周 凡 黃培煒 陳 祺 許金森

1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建福州 350108

非甾體抗炎藥（Non-steroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）相關(guān)性胃病是臨床的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重者可出現(xiàn)大面積潰瘍、出血，甚至危及生命等。目前臨床上NSAIDs 相關(guān)胃病治療藥物中，常規(guī)劑量的H2受體阻斷劑防治胃潰瘍效果不佳，米索前列醇的不良反應(yīng)發(fā)生率高、耐受性差[1-2]，質(zhì)子泵抑制劑（PPI）長期應(yīng)用可加重NSAIDs 相關(guān)性腸損傷、誘發(fā)胃癌等風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。經(jīng)絡(luò)理論指導(dǎo)下的針灸療法以其安全綠色、療效特異走向世界[5]。針刺（灸）足三里穴預(yù)防與治療胃黏膜損傷性疾病已有許多報(bào)道[6-8]，但將足三里“未病先防”與“既病防變”之功效聯(lián)合并用的報(bào)道不多見，本研究采用足三里穴“未病之時(shí)”預(yù)針刺結(jié)合“疾病后”注射生理鹽水的治療方式，探討針刺防治胃膜損傷的作用，初步分析其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF 級雄性SD 大鼠，體重：200～220 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK（淅）2019-0002；大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、西咪替丁治療組、足三里治療組，每組各8 只。

1.2 主要試劑

吲哚美辛對照品（S18048-5 g，純度99%，源葉生物科技有限公司）；西咪替丁注射液（國藥準(zhǔn)字H35021176，規(guī) 格2 ml ∶0.2 g×10 支，批號：2005241，福州福藥海王制藥有限公司）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（A005-1-2，南京建成生物工程研究所）；超氧化物岐化酶（SOD）試劑盒（A001-3-2，南京建成生物工程研究所）；微量丙二醛（MDA）測試盒（A003-2-1，南京建成生物工程研究所）；4%多聚甲醛（XS191108，Servicebio）；HE 染色試劑 盒（G1120，Solarbio），中性樹膠（G8590，Solarbio）；血紅素氧合酶1/熱休克蛋白32（HO-1）抗體（bs-2075R，Bioss）；核因子2 相關(guān)因子2（Nrf2）抗體（bs-1074R，Bioss）。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀（Varioskan Flash，Therom）；石蠟切片機(jī)（RM2235，Lecia）；組織包埋機(jī)（YB-7LF，孝感亞光）；組織脫水機(jī)（ZT-14V2，孝感亞光）；脫色搖床（TS-92，其林貝爾）；恒溫箱（DYY-6C，北京六一）；微波爐（MM721AAU-PW，美的）；顯微鏡（MDL，Lecia）；數(shù)顯恒溫電子水浴鍋（HH-6，常州國華）；離心機(jī)（ST16R，Therom）。

1.4 分組與預(yù)針刺

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：空白對照組、模型對照組、西咪替丁治療組、足三里治療組，每組各8 只。分組后，足三里治療組立即進(jìn)行預(yù)電針干預(yù)，具體方法：大鼠每日固定于黑色彈性鼠套，待安靜時(shí)，拉伸出左下肢，電針雙側(cè)足三里穴（電針參數(shù)：疏密波、刺激頻率為2 Hz/10 Hz），20 min/（次·d），連續(xù)6 d；模型對照組、西咪替丁治療組大鼠每日同時(shí)同等固定于鼠套20 min/（次·d），連續(xù)6 d，空白對照組不予任何處理。

1.5 造模與干預(yù)

預(yù)針刺結(jié)束后各組大鼠禁食不禁水18 h，第7 天模型對照組、西咪替丁治療組、足三里治療組大鼠腹腔注射35 mg/kg 吲哚美辛混懸液制備胃潰瘍模型。吲哚美辛注射60 min 后，對西咪替丁治療組、足三里治療組大鼠進(jìn)行干預(yù)，具體干預(yù)方法：西咪替丁治療組于肌肉點(diǎn)注射西咪替丁50 mg/kg，足三里治療組于雙側(cè)足三里穴注射生理鹽水0.5 ml/kg。注射部位定位[9-10]：足三里定位于后肢膝關(guān)節(jié)外下方當(dāng)腓骨小頭下約5 mm處，肌肉點(diǎn)定位于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，與足三里平行肌肉豐厚的非經(jīng)非穴點(diǎn)，避免其他經(jīng)脈、穴位作用的影響。

1.6 取材與指標(biāo)檢測

1.6.1 血清SOD、MDA、GSH-Px 檢測 吲哚美辛注射后7 h，各組大鼠腹腔注射1 0% 水合氯醛3 ml/kg、腹主動脈采血、離心、取血清，按南京建成試劑盒方法檢測SOD、MDA、GSH-Px。

1.6.2 胃黏膜大體觀察與胃潰瘍指數(shù)計(jì)算 大鼠采血完畢，暴露胃部，結(jié)扎幽門，從賁門處注射3 ml 4% 多聚甲醛，結(jié)扎賁門，剪取整胃，置4%多聚甲醛中固定30 min，取出胃，剪開，輕洗去多聚甲醛，用電子游標(biāo)卡尺測量胃黏膜出血點(diǎn)及潰瘍點(diǎn)，采用Guth 法[11]計(jì)算胃潰瘍指數(shù)（UI）。

1.6.3 胃組織病理形態(tài)學(xué) 觀察剪取典型部位胃組織塊1.0 cm×1.0 cm，置于4% 多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色、光鏡下觀察胃組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6.4 胃組織Nrf2、HO-1 免疫組化檢測 另取空白切片脫蠟至水，抗原修復(fù)、PBS 洗滌、山羊血清封閉、一抗孵育、HRP 標(biāo)記二抗孵育、DAB 染色、蘇木精復(fù)染，0.1% 鹽酸酒精分化，中性樹膠封片，光鏡100 倍下觀察Nrf2、HO-1 大致表達(dá)，400 倍視野下隨機(jī)選取4 張圖片，采用IPP 6.0分析每張圖片陽性表達(dá)的積分光密度（IOD），計(jì)算IOD/Area，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，資料符合正態(tài)分布，組間差異采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)，多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，多組間兩兩比較采用Dunnett T3法；資料不符合正態(tài)分布，組間差異采用K 個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)比較

與模型對照組比較，西咪替丁治療組、足三里治療組的胃潰瘍指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)比較（，n=8）

表1 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)比較（，n=8）

注：與模型對照組比較，**P ＜0.01；潰瘍抑制率（%）=（模型對照組平均UI-治療組平均UI）/模型對照組平均UI×100%；“-”表示無數(shù)據(jù)

2.2 各組大鼠胃黏膜組織形態(tài)學(xué)比較

肉眼可見，模型對照組大鼠胃黏膜外觀損傷嚴(yán)重，胃黏膜變薄，皺襞減少，有明顯的出血及潰瘍點(diǎn)；西咪替丁治療組、足三里治療組胃黏膜外觀損傷狀況明顯輕于模型對照組；光鏡下，空白對照組大鼠胃黏膜層完整，上皮細(xì)胞和腺體排列整齊均勻，大小基本一致，胃小凹結(jié)構(gòu)清晰，未見充血、腫脹；模型對照組大鼠黏膜上皮細(xì)胞變性、脫落、腺體排列紊亂、腺體與胃小凹之間分界模糊不清，部分黏膜層可見紅細(xì)胞、水腫。西咪替丁治療組、足三里治療組胃黏膜上皮細(xì)胞脫落、變性較輕，胃小凹結(jié)構(gòu)尚清晰，腺體排列局部紊亂，少見紅細(xì)胞。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜病理形態(tài)比較（HE×200）

2.3 各組血清SOD、GSH-Px活力、MDA含量比較

與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清SOD、GSH-Px 活力明顯下降（P＜0.01），MDA 含量明顯上升（P＜0.05）；與模型對照組比較，西咪替丁治療組、足三里治療組GSH-Px 活力升高（P＜0.05、P＜0.01）、MDA 含量下降（P＜0.01、P＜0.05），SOD活力呈一定升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組大鼠血清SOD、GSH-Px活力、MDA含量比較（，n=8）

表2 各組大鼠血清SOD、GSH-Px活力、MDA含量比較（，n=8）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

2.4 各組大鼠胃組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)情況

Nrf2、HO-1 在大鼠胃黏膜組織胞漿、胞核均有表達(dá)，呈棕黃色或棕褐顆粒。與空白對照組比較，西咪替丁治療組Nrf2 陽性表達(dá)減少（P＜0.05），足三里治療組Nrf2 陽性表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）；與模型對照組比較，西咪替丁治療組Nrf2 陽性表達(dá)明顯減少（P＜0.01），足三里治療組Nrf2 陽性表達(dá)呈增強(qiáng)的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空白對照組比較，模型對照組、西咪替丁治療組HO-1 表達(dá)明顯減少（P＜0.05、P＜0.01）；與模型對照組比較，足三里治療組HO-1 表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；與西咪替丁治療組比較，足三里治療組Nrf2、HO-1 陽性表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠Nrf2、HO-1 表達(dá)比較（×400）

表3 各組大鼠胃組織Nrf2、HO-1表達(dá)比較（IOD/Area，，n=8）

表3 各組大鼠胃組織Nrf2、HO-1表達(dá)比較（IOD/Area，，n=8）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與西咪替丁治療組比較，◇◇P ＜0.01

3 討論

針灸療效受諸多因素影響，除經(jīng)脈、腧穴的主治功能外，個(gè)體的狀態(tài)、疾病的進(jìn)程[12-13]、針刺的刺激量、療程[14-15]、調(diào)神得氣[16-17]等對針灸效應(yīng)的發(fā)揮亦十分重要。《靈樞·九針十二原》中提到“刺之要，氣至而有效”[18]，說明“氣至”是針刺起效的關(guān)鍵。《難經(jīng)·七十八難》云“當(dāng)刺之時(shí)，必先以左手厭按所針榮俞之處，彈而努之，爪而下之，其氣之來，如動脈之狀”[19]，詳述了對“氣至”的激發(fā)。《難經(jīng)·八十難》又道“謂左手見氣來至，乃內(nèi)針”[19]，提出了“氣至”應(yīng)在針刺治療前。良性的預(yù)針（灸）對多種疾病具有一定的療效，現(xiàn)代研究表明，預(yù)針灸可能通過啟動機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)體系，糾正疾病狀態(tài)下生化、分子標(biāo)記物的改變[20-22]。

足三里為足陽明胃經(jīng)下合穴，“合治內(nèi)府”，為治療胃腑疾病首選穴位之一。筆者前期工作發(fā)現(xiàn)，單次針刺足三里（或穴位注射）對無水乙醇、非甾體抗炎藥實(shí)驗(yàn)性急性胃潰瘍療效不夠顯著。在此基礎(chǔ)上，本研究基于中醫(yī)“治未病”的思想，采用防治結(jié)合的方案，通過預(yù)針刺足三里疏通經(jīng)絡(luò)、激發(fā)胃經(jīng)經(jīng)氣，并在胃潰瘍造模后足三里注射生理鹽水，取得了較好的療效，其胃黏膜保護(hù)作用與50 mg/kg 西咪替丁肌肉注射相當(dāng)。

非甾體抗炎藥胃黏膜損傷機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括直接損傷胃黏膜屏障、抑制胃黏膜環(huán)氧化酶（COX）的活性、降低胃黏膜血流量、氧自由基損傷等[23]。其中，氧自由基參與了NSAIDs 胃病局部直接損傷和吸收后損傷的多個(gè)環(huán)節(jié)，SOD、GSH-Px 是機(jī)體重要的酶類自由基清除因子，MDA 可間接反映組織過氧化損傷程度。本研究結(jié)果顯示，胃潰瘍模型大鼠存在著明顯的氧化還原失衡狀態(tài)，SOD、GSH-Px 活力下降，MDA 含量升高；針刺足三里可一定程度地糾正這一狀態(tài)。

Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件（Keap1-Nrf2-ARE）通路被認(rèn)為是細(xì)胞抗氧化機(jī)制中最重要的通路，Nrf2 通過核轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)了HO-1、SOD、GST 等多種抗氧化物酶、藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄[24]，促進(jìn)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激。誘導(dǎo)型HO-1 對氧化應(yīng)激反應(yīng)敏感，催化血紅素、阻止游離血紅素參與氧化反應(yīng)。本研究中足三里治療組胃組織Nrf2、HO-1 蛋白陽性表達(dá)升高，提示針刺足三里可能激活了Nrf2/HO-1 通路增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，促進(jìn)胃黏膜修復(fù)。

綜上所述，足三里預(yù)針刺結(jié)合穴位注射對吲哚美辛實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍具有保護(hù)與修復(fù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化有關(guān)。