李肇蕤 李孟知 程子娟 曹 娜 劉漫君 朱 琳 夏春波

1.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，廣西桂林 541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，廣西桂林 541001；3.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西桂林 541001

阿 爾茲海默 ?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，通常會(huì)導(dǎo)致包括學(xué)習(xí)和記憶在內(nèi)的認(rèn)知功能的嚴(yán)重?fù)p害，全球受到其影響的人超過4000 萬，并且預(yù)計(jì)未來幾十年內(nèi)會(huì)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚[1-3]。為開展AD 相關(guān)研究，眾多學(xué)者嘗試了各種模式生物，目前雖已有多種認(rèn)知障礙動(dòng)物模型造模方法[4-6]，但各有優(yōu)缺點(diǎn)。選擇合適的認(rèn)知障礙動(dòng)物模型是AD 實(shí)驗(yàn)研究的重要組成部分，為此本研究利用Morris 水迷宮系統(tǒng)對(duì)三種不同認(rèn)知障礙大鼠模型的造模效果進(jìn)行比較，為認(rèn)知障礙動(dòng)物研究提供更客觀、可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

45 只健康成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，體重200～300 g，均由桂林醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK 桂2007-0001。在實(shí)驗(yàn)開始前運(yùn)用Morris 水迷宮系統(tǒng)進(jìn)行篩選，剔除游泳障礙、原地旋轉(zhuǎn)與靜止不動(dòng)的大鼠后剩余40 只，隨機(jī)將其分為檸檬酸鋁組、亞硝酸鈉組、鈉鋁聯(lián)合注射組與對(duì)照組，每組各10 只。環(huán)境溫度為22～26 ℃，自然晝夜節(jié)律。大鼠自由進(jìn)食、飲水，所有實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)，獲得桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與設(shè)備

檸檬酸鋁、亞硝酸鈉均購自源葉生物科技有限公司，Morris 水迷宮系統(tǒng)（XR-XM101，上海欣軟）。

1.3 認(rèn)知障礙模型建立

各組大鼠稱量體重后，檸檬酸鋁組腹腔注射5% 檸檬酸鋁水溶液，劑量為120 mg/kg。亞硝酸鈉組腹腔注射3% 亞硝酸鈉水溶液，劑量為30 mg/kg。鈉鋁聯(lián)合注射組以相同的劑量同時(shí)腹腔注射以上兩種試劑。以上三組均隔天給藥，共持續(xù)60 d，并隨體重變化調(diào)整藥物注射量。對(duì)照組未施加任何干擾因素，各組大鼠給予充足的食物與水。

1.4 認(rèn)知障礙模型學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)價(jià)

給藥60 d 后利用Morris 水迷宮進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)。定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)共持續(xù)4 d，每天進(jìn)行4 次，每次間隔3 min。透明逃生平臺(tái)被放置在圓形游泳池第四象限水下，記錄大鼠分別從4 個(gè)象限入水點(diǎn)入水到爬上平臺(tái)所需的時(shí)間（逃避潛伏期），若大鼠120 s 內(nèi)沒有爬上平臺(tái)，則將逃避潛伏期記錄為120 s 并將大鼠置于平臺(tái)上停留15 s 以熟悉位置，計(jì)算每天平均逃避潛伏期?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：于定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第5 天進(jìn)行。在此實(shí)驗(yàn)中撤去逃生平臺(tái)，大鼠于原平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限入水，記錄120 s 內(nèi)大鼠跨越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。平均逃避潛伏期、跨越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則判定為學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

表1 定位航行實(shí)驗(yàn)中各組大鼠平均逃避潛伏期（，s）

表1 定位航行實(shí)驗(yàn)中各組大鼠平均逃避潛伏期（，s）

注：與對(duì)照組比較，*LSD-t=5.195，*P ＜0.05；#LSD-t=3.998，#P ＜0.05

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件與Graphpad Prism 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析作圖。計(jì)量資料以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較運(yùn)用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。第3 天起，與對(duì)照組比較，鈉鋁聯(lián)合注射組大鼠平均逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），檸檬酸鋁組與亞硝酸鈉組平均逃避潛伏期與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示檸檬酸鋁組與亞硝酸鈉組大鼠仍有較強(qiáng)的學(xué)習(xí)獲取能力，而鈉鋁聯(lián)合注射組大鼠學(xué)習(xí)獲取能力較差。見表1、圖1～2。

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對(duì)照組比較，鈉鋁聯(lián)合注射組大鼠跨越原平臺(tái)位置次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），檸檬酸鋁組和亞硝酸鈉組跨越原平臺(tái)位置次數(shù)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示檸檬酸鋁組大鼠與亞硝酸鈉組大鼠空間記憶能力未有明顯改變，而鈉鋁聯(lián)合注射組大鼠空間記憶能力減弱。見表2、圖1～2。

表2 空間探索實(shí)驗(yàn)各組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)（，次）

表2 空間探索實(shí)驗(yàn)各組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)（，次）

注：與對(duì)照組比較，*LSD-t=3.211，*P ＜0.05

圖1 各組大鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 各組大鼠Morris 水迷宮游泳軌跡

3 討論

海馬作為中樞邊緣系統(tǒng)的一部分，其結(jié)構(gòu)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，AD 早期最主要的表現(xiàn)是學(xué)習(xí)記憶能力的下降[7-8]。Morris 水迷宮是評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典方法，在AD 動(dòng)物模型的研究領(lǐng)域中被廣泛運(yùn)用[9-10]。大鼠與一般動(dòng)物相比，具有繁殖能力強(qiáng)、生存率高、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，有利于進(jìn)行大樣本的實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)又具有較強(qiáng)的快速學(xué)習(xí)能力，是目前最廣泛用于AD 模型制備的動(dòng)物[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射相應(yīng)試劑的方式建立認(rèn)知障礙大鼠模型，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，鈉鋁聯(lián)合注射組大鼠逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、跨越平臺(tái)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。單純注射檸檬酸鋁或亞硝酸鈉組的大鼠逃避潛伏期、跨越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。人體的生長(zhǎng)及大腦發(fā)育都離不開金屬元素的作用[14]，金屬離子長(zhǎng)期處于異常水平時(shí)可導(dǎo)致大腦缺氧從而導(dǎo)致嚴(yán)重的腦外傷[15-17]。研究表明，金屬鋁與認(rèn)知障礙發(fā)生關(guān)系最為密切，鋁導(dǎo)致的學(xué)習(xí)與記憶能力下降主要與線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷和多種蛋白功能障礙有關(guān)[18-20]。亞硝酸鈉會(huì)導(dǎo)致腦缺氧、神經(jīng)遞質(zhì)濃度失衡以及神經(jīng)元壞死[21-23]。本實(shí)驗(yàn)檸檬酸鋁與亞硝酸鈉聯(lián)合注射取得了良好的造模效果，推測(cè)可能與鈉鋁聯(lián)合作用導(dǎo)致的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)濃度失衡、海馬組織功能受損有關(guān)。

綜上所述，大鼠腹腔聯(lián)合注射檸檬酸鋁和亞硝酸鈉的造模方法較好的模擬了AD 的病理改變，結(jié)果顯示大鼠有明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，造模效果優(yōu)于單獨(dú)腹腔注射檸檬酸鋁或亞硝酸鈉，操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性強(qiáng)，是較為理想的認(rèn)知障礙大鼠模型。