余 薇，周鵬程，陳科伶，唐文君

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610072;2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見(jiàn)的以持續(xù)呼吸道癥狀和氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病，呼吸道癥狀和氣流受限由有毒顆?；驓怏w導(dǎo)致氣道和/或肺泡異常引起，是呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)疾病之一[1]。世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)該病到2020年將位于全球死亡原因第三位，世界疾病負(fù)擔(dān)第五位[1]。最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)40歲以上人群COPD患病率高達(dá)13.7%[2]，中國(guó)患者每年平均發(fā)生0.5～3.5次急性加重[3]，年人均疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)高達(dá)20 107.58元，24.4%～24.8%的患者處于極高經(jīng)濟(jì)風(fēng)險(xiǎn)[4]。隨著老年化社會(huì)的加劇以及環(huán)境污染等多種因素作用，我國(guó)COPD的防治任務(wù)十分艱巨。氣管支氣管軟化癥是因慢性炎癥等因素導(dǎo)致氣道軟骨變性、壞死或膜部松弛，管壁失去支撐作用，管腔受胸內(nèi)外壓力改變并隨著呼吸運(yùn)動(dòng)呈動(dòng)態(tài)性狹窄的一種病理狀態(tài)[5]，臨床表現(xiàn)為反復(fù)肺部感染、肺功能加速惡化和呼吸衰竭，甚至猝死，危害巨大。目前普遍認(rèn)為COPD是導(dǎo)致氣管支氣管軟化癥的最主要危險(xiǎn)因素之一， COPD合并氣管支氣管軟化癥的檢出率高達(dá)53%～59%[6-7]。而氣管支氣管軟化癥則進(jìn)一步加速COPD病情進(jìn)展，因此改善或阻斷氣管支氣管軟化對(duì)于改善COPD不良事件結(jié)局及降低社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等具有重大意義。目前COPD合并氣管支氣管軟化癥發(fā)病機(jī)制不清，缺乏有效治療藥物及方法，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有相關(guān)的模型制備方法報(bào)道，嚴(yán)重影響了對(duì)疾病病理機(jī)制的深入理解以及對(duì)潛在的干預(yù)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。本課題組建立了一種COPD合并氣管支氣管軟化癥模型并評(píng)價(jià)了調(diào)補(bǔ)肺腎方的干預(yù)機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 大鼠氣管軟骨細(xì)胞(Procell CP-R087)。調(diào)補(bǔ)肺腎方由骨碎補(bǔ)15 g、桑寄生15 g、川牛膝10 g、黃芪30 g、人參15 g、熟地黃15 g、補(bǔ)骨脂15 g、丹參15 g、山茱萸15 g、續(xù)斷15 g、浙貝母10 g、矮地茶15 g、甘草5 g組成，制備成免煎顆粒，根據(jù)人與大鼠等效劑量的折算系數(shù)換算大鼠劑量(人與大鼠的折算系數(shù)為6.3，調(diào)補(bǔ)肺腎方對(duì)大鼠的等效給藥劑量(g/kg)=人體有效劑量(g/kg)×6.3換算而得)，加入滾開(kāi)水?dāng)嚢杈鶆颍浞秩芙夂?，冷卻，冰箱冷藏備用，使用時(shí)過(guò)濾除菌，按比例(0%，1%，5%，10%，15%，20%)加入正常培養(yǎng)基，流式細(xì)胞分析檢測(cè) 24 h 細(xì)胞凋亡率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選合適作用濃度。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒(CW0581M，CWBIO 康為世紀(jì))；HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒(CW2569M，CWBIO 康為世紀(jì))；內(nèi)參一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH(TA-08，中杉金橋，1/2 000 ) ；二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305，中杉金橋，1/2 000)；目的一抗：Rabbit monoclonal Anti-caveolin-1(ab32577，abcam，1/1 000～1/10 000)；目的一抗：Rabbit Polyclonal Anti-p-p38(bs-0636，Bioss，1/500～1/2 000)；BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit(AP101-100-kit，MULTI SCIENCES 聯(lián)科生物)；軟骨染色液(甲苯胺藍(lán)法)(8101A16，LEAGENE)；CollagenⅡAntibody(AF0135，Affinity)；大鼠軟骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基(CM-R087 Procell)；p38-MAPK(HY-10256 MCE)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)(203014-10Genscript)；CCK8試劑盒(KGA317，凱基生物)；熒光PCR儀[CFX ConnectTM實(shí)時(shí)，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]；蛋白垂直電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[Chemi DocTM XRS+，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀[艾森生物(杭州)有限公司，型號(hào)：NovoCyte 2060R]。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1香煙煙霧提取物(CSE)的制備 將 1支去過(guò)濾嘴香煙連于一個(gè)連續(xù)抽吸驅(qū)動(dòng)裝置點(diǎn)燃，抽吸5 min，以5 cmH2O(約 0.1 kPa)的負(fù)壓持續(xù)吸引。吸入的煙霧經(jīng)過(guò)真空容器的一個(gè)入口通入10 mL PBS液中制成懸液，懸液用1 mol/L的NaOH調(diào)制 pH至 7.4，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾作為CSE原液。配制好的CSE于30 min之內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。流式凋亡摸索 CSE 的處理濃度(0%，2.5%，10%，20%，30%，40%，50%)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選合適作用濃度。

1.3.2分組、造模及干預(yù) 實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、模型+調(diào)補(bǔ)肺腎方組?？瞻捉M以低糖DMEM和1%FBS培養(yǎng)。模型組、模型+調(diào)補(bǔ)肺腎方組以低糖DMEM和1%FBS培養(yǎng)基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)[8]方法用CSE處理氣管軟骨細(xì)胞(Procell CP-R087)48 h構(gòu)建COPD 細(xì)胞模型，COPD細(xì)胞模型構(gòu)建成功后，加入白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)10 ng/mL干預(yù)24 h建立COPD合并氣管支氣管軟化癥模型(甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色對(duì)模型進(jìn)行鑒定)，然后換培養(yǎng)液，模型組用正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，模型+調(diào)補(bǔ)肺腎方組用含調(diào)補(bǔ)肺腎方培養(yǎng)基繼續(xù)干預(yù) 48 h。

1.3.3流式細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集(1～3)×106個(gè)細(xì)胞，加1 mL PBS 1 500 r/min 離心，3 min，洗2遍，用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer，取300 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，每管各加入3 μL Annexin V-FITC和5 μL PI-PE，輕微混勻后，室溫避光孵育10 min，再向每管中加入200 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer，混勻后上流式儀檢測(cè)。

1.3.4甲苯胺藍(lán)染色觀察 去除孔中的培養(yǎng)基，然后加入PBS清洗3次，每次5 min，再加入軟骨染色液，浸染15～20 min(根據(jù)細(xì)胞量的多少而定)，自來(lái)水洗2 min，再吸干，加入丙酮分化至軟骨細(xì)胞呈紫藍(lán)色清楚可見(jiàn)，逐級(jí)乙醇脫水，封片，鏡檢。

1.3.5Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min；0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20 min；培養(yǎng)皿加入新鮮配制的3%雙氧水，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉液，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗；PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次5 min，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)的PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5%BSA，37 ℃封閉30 min；用移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)的封閉液，不洗，每個(gè)培養(yǎng)皿滴加足夠量的稀釋好的一抗；Collagen Ⅱ(1:200)放入濕盒中，4 ℃孵育過(guò)夜，取出4 ℃孵育過(guò)培養(yǎng)皿，室溫靜置45 min，PBS浸洗玻片3次，每次5 min，滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS充分淋洗；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS或自來(lái)水沖洗1 min；蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化，返藍(lán)；自來(lái)水沖洗1 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3.6軟骨細(xì)胞中p-p38、caveolin-1表達(dá)Western blot檢測(cè) 利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。蛋白變性、上樣、電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。4 ℃孵育一抗(Rabbit monoclonal Anti-caveolin-1、Rabbit Polyclonal Anti-p-p38)溶液過(guò)夜；室溫孵育二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.3.7軟骨細(xì)胞中MMP-3、caveolin-1 mRNA表達(dá)RT-PCR檢測(cè) 取各組細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，提取RNA后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算出各組的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：MMP-3上游引物為5’-TTCCTTGGGCTGAAGATGAC-3’，下游引物為5’-GATCCTGGAGAATGTGAGTGG-3’;caveolin-1上游引物為5’-CAAATGCCACTTTGCTCAGA-3’，下游引物為5’-ACAAAGCCATTTCCCAAGTG-3’;GAPDHF上游引物為5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物為CGCCAGTAGACTCCACGAC-3’。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性，呈正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度CSE干預(yù)軟骨細(xì)胞凋亡率 Annexin-V FITC/PI雙染流式細(xì)胞分析顯示，空白組凋亡率為8.90%，2.5%，10%，20%，30%，40%，50%濃度CSE干預(yù)后軟骨細(xì)胞凋亡率分別為23.35%，83.95%，88.33%，77.25%，90.69%，85.99%，其中2.5%濃度CSE干預(yù)后氣管軟骨細(xì)胞凋亡率最低，因此確定2.5%CSE作為實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2不同濃度調(diào)補(bǔ)肺腎方干預(yù)軟骨細(xì)胞凋亡率 Annexin-V FITC/PI雙染流式細(xì)胞分析顯示，空白組凋亡率為8.34%，1%，5%，10%，15%，20%濃度調(diào)補(bǔ)肺腎方干預(yù)后軟骨細(xì)胞凋亡率分別為10.95%，27.39%，47.61%，49.27%，66.04%，其中1%濃度調(diào)補(bǔ)肺腎方干預(yù)后氣管軟骨細(xì)胞凋亡率最低，因此調(diào)補(bǔ)肺腎方最佳實(shí)驗(yàn)濃度確定為1%。

2.3各組軟骨細(xì)胞倒置顯微鏡下表現(xiàn) 空白組軟骨細(xì)胞大小一致，呈多角形，胞漿豐富，胞體大，1～2個(gè)核仁清晰可見(jiàn)；模型組軟骨細(xì)胞狹長(zhǎng)，多為單層生長(zhǎng)，胞內(nèi)可見(jiàn)較多空泡形成，核仁變形，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；模型+調(diào)補(bǔ)肺腎方組軟骨細(xì)胞大小較均勻，呈橢圓形或多角形，形態(tài)較規(guī)則，胞漿多，胞體大，核仁較清晰。見(jiàn)圖1。

圖1 各組軟骨細(xì)胞倒置顯微鏡下表現(xiàn)

2.4各組軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色表現(xiàn) 空白組可見(jiàn)軟骨細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色異染顆粒，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞周圍有少量淺藍(lán)色異染顆粒，1～2個(gè)核仁清晰可見(jiàn)；模型組軟骨細(xì)胞染色明顯變淺，細(xì)胞狹長(zhǎng)，多為單層生長(zhǎng)，胞內(nèi)可見(jiàn)較多空泡形成，核仁變形，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞明顯退變；模型+調(diào)補(bǔ)肺腎方組軟骨細(xì)胞胞質(zhì)呈淺藍(lán)色，核仁較清晰，胞內(nèi)可見(jiàn)少許空泡，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則。見(jiàn)圖2。

圖2 各組軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色表現(xiàn)

2.5各組軟骨細(xì)胞免疫組化染色表現(xiàn) 空白組軟骨細(xì)胞胞漿被染成棕黃色，其中可見(jiàn)黃褐色顆粒，細(xì)胞外也可見(jiàn)棕黃色染色，所有的軟骨細(xì)胞中均可見(jiàn)Ⅱ型膠原的表達(dá)；模型組Ⅱ型膠原表達(dá)明顯減弱，基本為陰性；模型+調(diào)補(bǔ)肺腎方組Ⅱ型膠原表達(dá)減弱，在較多軟骨細(xì)胞質(zhì)及胞外可見(jiàn)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組軟骨細(xì)胞免疫組化染色表現(xiàn)

2.6各組軟骨細(xì)胞中p-p38、caveolin-1表達(dá)情況 模型組中p-p38、caveolin-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，模型+調(diào)補(bǔ)肺腎方組均明顯低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組軟骨細(xì)胞中p-p38、caveolin-1表達(dá)情況

2.7各組軟骨細(xì)胞中MMP-3、caveolin-1 mRNA表達(dá)情況 模型組中MMP-3、caveolin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，模型+調(diào)補(bǔ)肺腎方組均明顯低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組軟骨細(xì)胞中MMP-3、caveolin-1 mRNA表達(dá)情況

3 討 論

氣管支氣管軟化癥好發(fā)于氣管、左右主支氣管及右肺中間段等中央氣道，是兒童常見(jiàn)的先天性氣道發(fā)育不全性疾病，而成人可見(jiàn)于氣管插管或切開(kāi)、氣管外傷、氣道結(jié)核、COPD、甲狀腺或縱隔腫瘤、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、Mounier-Kuhn綜合征等疾病[9]。目前認(rèn)為COPD是氣管支氣管軟化癥最常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素之一，但其誘導(dǎo)氣管支氣管軟化癥的機(jī)制仍舊不明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與反復(fù)的慢性氣道炎癥、肺氣腫有關(guān)[10]。Sverzellati等[11]發(fā)現(xiàn)氣道管壁越厚軟化癥越重。Murgu等[12]運(yùn)用超聲內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)COPD合并氣管軟化癥不僅軟骨環(huán)存在不規(guī)則增厚，而且膜部組織明顯變薄松弛。隨著研究的深入，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為氣管支氣管軟骨細(xì)胞的退變是氣管軟化癥的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)，因此進(jìn)一步了解軟骨細(xì)胞的退變機(jī)制對(duì)于找到有效的治療方法或藥物具有十分重要的意義。

迄今為止尚沒(méi)有COPD合并氣管支氣管軟化癥的疾病模型，這對(duì)于深入了解其發(fā)病機(jī)制存在挑戰(zhàn)。臨床上并非所有的COPD會(huì)伴隨氣管支氣管軟化癥的發(fā)生，為了讓COPD模型出現(xiàn)明確的氣管軟骨退變，在本實(shí)驗(yàn)中先采用CSE處理氣管軟骨細(xì)胞建立COPD細(xì)胞模型，然后參考骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變模型的制備方法[13-15]，加入10 ng/mL IL-1β誘導(dǎo)氣管軟骨退變，結(jié)果經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色和免疫組化染色證實(shí)采用CSE聯(lián)合 IL-1β處理氣管軟骨細(xì)胞能夠成功制備COPD合并氣管支氣管軟化癥模型。

caveolae相關(guān)蛋白最初由日本Yamada在1955年使用電子顯微鏡觀察小鼠膽囊上皮細(xì)胞質(zhì)膜時(shí)發(fā)現(xiàn)，最初認(rèn)為與細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[16]。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)有3種caveolin蛋白，分別為caveolin-1, caveolin-2, caveolin-3，其中caveolin-1是caveolae主要的結(jié)構(gòu)蛋白，現(xiàn)在認(rèn)為該蛋白與肺氣腫和骨關(guān)節(jié)炎等衰老性疾病密切相關(guān)[17]。唐躍瓊等[18]發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨的損害程度與caveolin-1的表達(dá)呈正相關(guān)，且IL-1β呈時(shí)間依賴性地促進(jìn)軟骨細(xì)胞表達(dá)caveolin-1，后者又誘導(dǎo)p38MAPK信號(hào)通路激活，使軟骨基質(zhì)中II型膠原和蛋白多糖降解增多。本研究顯示，模型組caveolin-1蛋白表達(dá)水平明顯高于空白組，表明caveolin-1參與了COPD模型氣管軟骨細(xì)胞退變過(guò)程。

p38MAPK是一種分子量為38kD的酪氨酸磷酸化蛋白激酶，能被細(xì)胞外環(huán)境的改變、促炎因子等多種細(xì)胞外刺激所激活，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、退變、衰老及凋亡等多種生理病理過(guò)程[19]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號(hào)通路在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中可能處于一個(gè)樞紐地位，與軟骨細(xì)胞表型的保持和分化、軟骨細(xì)胞的肥大和鈣化、凋亡、軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶的合成、軟骨炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生等都有密切關(guān)系[20]。本研究顯示，模型組p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯高于空白組，表明p38MAPK參與了COPD模型氣管軟骨細(xì)胞退變過(guò)程。

MMPs是一系列以降解細(xì)胞外基質(zhì)成分為主要功能的金屬蛋白酶，可引起軟骨基質(zhì)的破壞進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能的紊亂，MMP-3是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，在基質(zhì)降解中具有主要作用[21]。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，IL-1β可誘導(dǎo)MMPs表達(dá)上調(diào)，p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了這一過(guò)程， MMPs的表達(dá)增加導(dǎo)致軟骨膠原的降解加強(qiáng)。本研究顯示，模型組MMP-3蛋白表達(dá)水平明顯高于空白組，表明MMP-3參與了COPD模型氣管軟骨細(xì)胞退變過(guò)程。

調(diào)補(bǔ)肺腎方是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院治療COPD的常用協(xié)定方，全方由骨碎補(bǔ)、桑寄生等13味藥物組成，具有補(bǔ)肺益腎、止咳定喘之功，方中黃芪、黨參補(bǔ)肺益腎，山茱萸、熟地黃滋陰補(bǔ)血，骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、續(xù)斷補(bǔ)腎強(qiáng)骨，丹參、牛膝活血化瘀，矮地茶止咳平喘，浙貝母肅肺化痰，甘草調(diào)和諸藥。前期研究顯示，在常規(guī)對(duì)癥治療基礎(chǔ)上聯(lián)合調(diào)補(bǔ)肺腎方治療COPD合并氣管支氣管軟化癥較單純西醫(yī)治療能夠更好地改善患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，改善FEV1等肺功能指標(biāo)[23]。本研究結(jié)果顯示，模型+調(diào)補(bǔ)肺腎方組甲苯胺藍(lán)染色顯示軟骨細(xì)胞形態(tài)相對(duì)規(guī)則，胞內(nèi)空泡較少，退變明顯減輕；免疫組化法顯示Ⅱ型膠原表達(dá)減弱，在較多軟骨細(xì)胞質(zhì)及胞外可見(jiàn)；軟骨細(xì)胞中p-p38、caveolin-1表達(dá)水平和MMP-3、caveolin-1 mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組。提示調(diào)補(bǔ)肺腎方可能通過(guò)下調(diào)caveolin-1、p38MAPK、MMP-3表達(dá)，從而減輕軟骨細(xì)胞退變，保護(hù)氣管軟骨。

本研究首次提出了COPD合并氣管支氣管軟化癥模型的制備方法，并發(fā)現(xiàn)調(diào)補(bǔ)肺腎方能通過(guò)降低caveolin-1、p-p38、MMP-3的表達(dá)，從而保護(hù)氣管軟骨細(xì)胞退變，部分闡述了中藥復(fù)方干預(yù)軟骨細(xì)胞退變的作用機(jī)制，具有開(kāi)創(chuàng)性意義。但因研究經(jīng)費(fèi)有限，本研究?jī)H對(duì)幾個(gè)主要指標(biāo)進(jìn)行了觀察，而中藥有效成分眾多，往往發(fā)揮著多靶點(diǎn)及多信號(hào)通路作用，下一步需要借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)或者多組學(xué)技術(shù)等進(jìn)一步闡述其作用機(jī)制，從而提高中醫(yī)藥治療水平。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。