侯季秋，陳雅麗，王 超，馬 迪，靳會會，安 瑩，趙海濱

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

隨著生活節(jié)奏的改變，焦慮的發(fā)病率日益增高。WHO在2017年發(fā)布的精神疾病報告中顯示，焦慮在心肌梗死患者中的發(fā)病率約為30%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在普通人中的發(fā)病率(5%～10%)[1]，而焦慮會增加心肌梗死后36%的心臟不良事件發(fā)生率[2]。最新研究表明，炎癥反應(yīng)與心肌梗死后焦慮的發(fā)生關(guān)系密切[3]，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性因子釋放，是焦慮發(fā)生的重要病理機(jī)制[4]。NLRP3是細(xì)胞內(nèi)模式識別受體，由凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和效應(yīng)蛋白Caspase-1組成，其出現(xiàn)在大腦神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中，并與壓力誘導(dǎo)的情緒障礙發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[5]。在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，NLRP3激活后可通過活化Caspase-1，切割GSDMD蛋白，使其在細(xì)胞膜表面形成質(zhì)膜孔(10～15 nm)而引起炎性因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)釋放的一種程序性炎性脹亡[6-8]。前期研究已證明，心肌梗死合并焦慮小鼠NF-κB等炎癥介質(zhì)含量明顯高于非焦慮的心肌梗死大鼠[9]，柴胡加龍骨牡蠣湯在一定程度上可通過增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞動員，抑制心肌梗死合并焦慮大鼠的炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)大鼠海馬區(qū)谷氨酸受體N-甲基d天冬氨酸受體(NMDAR)和γ氨基丁酸A受體(GABAAR)神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，改善心肌梗死后的焦慮狀態(tài)[10]。本研究從NLRP3/GSDMD通路介導(dǎo)海馬區(qū)神經(jīng)炎癥進(jìn)一步探析柴胡加龍骨牡蠣湯治療心肌梗死合并焦慮的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK(北京)2016-0011，飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房。考慮心肌梗死造模成功率為70%～85%，購進(jìn)60只大鼠。

1.2實驗藥物、試劑及儀器 柴胡加龍骨牡蠣湯組成：柴胡12 g、黃芩9 g、龍骨15 g、牡蠣15 g、生姜9 g、黨參9 g、桂枝9 g、茯苓15 g、半夏9 g、大黃9 g、珍珠母15 g、大棗10 g，配方顆粒購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。Anti-GSDMD抗體(ab219800)、Anti-NLRP3抗體(ab214185)、Anti-IL-1β抗體(ab9787)購于abcam公司，Caspase-1/p20/p10抗體(10663-1-AP)、IL-18抗體(10663-1-AP)、IL-1β抗體(10663-1-AP)購于proteintech公司。小動物呼吸機(jī)，高架十字迷宮，曠場及攝影機(jī)，全自動三導(dǎo)聯(lián)心電圖機(jī)，酶標(biāo)儀(Thermo)，離心機(jī)，微量移液器，垂直電泳槽，電轉(zhuǎn)儀，磁力攪拌器等。

1.3實驗方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組9只、心梗并焦慮組17只、心梗組17只、心梗并焦慮+中藥組17只。心梗并焦慮組和心梗并焦慮+中藥組先采用空瓶刺激方法進(jìn)行焦慮造模，于造模第15天采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支方法進(jìn)行心肌梗死造模。心梗組采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支方法進(jìn)行造模；假手術(shù)組穿線后不打結(jié)，其余步驟同心肌梗死造模。①焦慮造模方法參考文獻(xiàn)[8]：第1～7天每日9:00—9:10和21:00—21:10給予飲水，其余時間禁水。第8～21天每日早晚隨機(jī)一個時間段給予空瓶，另一時間段喂水。造模期間大鼠自由飲食，造模周期共21d。②心肌梗死造模方法參考文獻(xiàn)[9]：采用1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)口連接氣管插管后，連接小動物呼吸機(jī)，呼吸機(jī)模式：心率80次/min，潮氣量2 mL/100 g，吸呼比1∶2。于左側(cè)第三、第四肋骨間打開胸腔，暴露左心耳邊緣區(qū)域，用5-0帶線縫合針于左心耳前下方2 mm部位進(jìn)行結(jié)扎。術(shù)后腹腔注射0.2 mL利多卡因防止心律失常，40萬IU青霉素預(yù)防術(shù)后感染，術(shù)后進(jìn)行有效保暖。以術(shù)后第2天心電圖I、aVL、V1～V6導(dǎo)聯(lián)中6個以上導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)病理性Q波為心肌梗死成功標(biāo)志。心肌梗死造模后第2天，心梗合并焦慮+中藥組給予柴胡加龍骨牡蠣湯10 mL/kg灌胃(參考文獻(xiàn)[9]，給藥量按成人體質(zhì)量60 kg的6倍劑量折算，折合大鼠每日生藥劑量為13.6 g/kg，每劑中藥顆粒用100 mL蒸餾水混勻)，其余組灌胃等量蒸餾水，均1次/d，連續(xù)7 d。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1心臟超聲檢測 實驗結(jié)束后對各組大鼠進(jìn)行心臟超聲檢測，記錄左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)和左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)。

1.4.2行為學(xué)測試 ①高架十字迷宮實驗：高架十字迷宮由4個高于地面50 cm的十字交叉架窄壁組成，包括2條開放臂(長、寬、高分別為50 cm、10 cm、1 cm)、2條封閉臂(長、寬、高分別為50 cm、10 cm、30 cm)、四臂之間的中央?yún)^(qū)(長、寬分別為10 cm、10 cm)及頂端攝像儀器。經(jīng)15 min環(huán)境適應(yīng)后，將大鼠面向開臂放入中央?yún)^(qū)，記錄5 min內(nèi)的活動情況，包括進(jìn)入開放臂次數(shù)(OE)及開放臂停留時間(OT)、進(jìn)入閉合臂次數(shù)(CE)及閉合臂時間(CT)，計算進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比和開放臂停留時間百分比。②曠場實驗：設(shè)置100 cm×100 cm×40 cm的灰色曠場箱，底面有25個方格，正上方有專用記錄攝像儀。將大鼠經(jīng)過10 min環(huán)境適應(yīng)后放入中央格，記錄3 min內(nèi)大鼠在曠場內(nèi)運(yùn)動情況，計算水平運(yùn)動得分(后腿離開一格記1分)和垂直運(yùn)動得分(前爪離地直立記1分)，評價大鼠水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動能力。

1.4.3大腦海馬區(qū)HE及尼氏染色 大鼠麻醉后，打開胸腔暴露心臟，將灌流針由心尖插入左心室，固定灌流針，先用生理鹽水快速灌注后使用10%福爾馬林溶液常速灌注固定，摘取大腦浸泡于4%的組織固定液中，經(jīng)沉淀后，制備石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色及尼氏染色。每組內(nèi)每張切片挑選海馬區(qū)域3個200倍視野進(jìn)行截圖，截圖時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。采用Image-Pro Plus 6.0軟件，分別測量區(qū)域尼氏藍(lán)色陽性面積及組織面積，計算尼氏陽性面積百分比。

1.4.4大腦海馬區(qū)NLRP3、Caspase-1、GSDMD免疫組化檢測 取制備的石蠟切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫組化圖像進(jìn)行半定量統(tǒng)計分析，每張切片采樣測量3處，計算單位面積下陽性染色區(qū)域面積，以積分光密度值(IOD值)表示。

1.4.5大腦海馬組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)Western blot檢測 將海馬組織剪碎提取總蛋白，經(jīng)過蛋白濃度測定及蛋白變性，制備電泳膠，進(jìn)行電泳分離及電轉(zhuǎn)移，封閉、一抗二抗孵育，晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,并使用GraphPad Prism 7.00制作圖表。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，正態(tài)分布且方差齊采用單因素方差分析，方差不齊采用Welchi檢驗；不符合正態(tài)分布，組間比較采用非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠存活情況 經(jīng)過結(jié)扎左冠脈前降支手術(shù)及慢性不可預(yù)知性空瓶刺激后，假手術(shù)組6只、心梗組9只、心梗并焦慮組8只、心梗并焦慮+中藥組9只存活。

2.2各組大鼠心臟超聲檢測指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，心梗并焦慮組、心梗組、心梗并焦慮+中藥組大鼠LVEF、LVFS均明顯降低(P均<0.05)，LVIDd和LVIDs均明顯增加(P均<0.05)，且心梗并焦慮組大鼠LVIDd明顯高于心梗組(P<0.05)；與心梗并焦慮組比較，心梗并焦慮+中藥組LVEF、LVFS均明顯升高(P均<0.05)，LVIDd和LVIDs均明顯縮短(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果比較

2.3各組大鼠行為學(xué)比較 高架十字迷宮實驗：心梗并焦慮組大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)所占比和開放臂停留時間所占比均明顯低于假手術(shù)組和心梗組(P均<0.05)，而心梗并焦慮+中藥組均明顯高于心梗并焦慮組(P均<0.05)。曠場實驗：心梗并焦慮組大鼠水平運(yùn)動得分和垂直運(yùn)動得分均明顯少于假手術(shù)組(P均<0.05)，且運(yùn)動得分明顯低于心梗組(P<0.05)，而心梗并焦慮+中藥組運(yùn)動得分和垂直運(yùn)動得分均明顯高于心梗并焦慮組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠行為學(xué)評測情況

2.4各組大鼠大腦海馬區(qū)HE及尼氏染色情況比較 假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常、輪廓清晰、圓潤飽滿, 胞質(zhì)著色均勻, 細(xì)胞核位于細(xì)胞中央, 排列緊密；心梗組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較假手術(shù)組減少，排列松散，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變；心梗并焦慮組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生了不同程度損傷,出現(xiàn)核固縮，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間隙變大；與心梗并焦慮組比較，心梗并焦慮+中藥組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列相對緊密，胞質(zhì)著色均勻, 細(xì)胞數(shù)量多。心梗并焦慮組和心梗組大鼠海馬區(qū)尼氏陽性面積均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，心梗組與心梗并焦慮組大鼠尼氏陽性面積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，心梗并焦慮+中藥組明顯高于心梗并焦慮組和心梗組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠腦部HE及尼氏染色情況

2.5各組大鼠海馬區(qū)NLRP3、Caspase-1、GSDMD免疫組化檢測情況比較 心梗并焦慮組和心梗組大鼠海馬區(qū)NLRP3、Caspase-1、GSDMD表達(dá)IOD值均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，且心梗并焦慮組GSDMD表達(dá)IOD值明顯高于心梗組(P<0.05)；心梗并焦慮+中藥組NLRP3、Caspase1、GSDMD表達(dá)IOD值均明顯低于心梗并焦慮組(P均<0.05)，且NLRP3表達(dá)IOD值明顯低于心梗組(P<0.05)。見圖4～6。

圖4 各組大鼠海馬區(qū)NLRP3免疫組化檢測情況

圖5 各組大鼠海馬區(qū)Caspase-1免疫組化檢測情況

圖6 各組大鼠海馬區(qū)GSDMD免疫組化檢測情況

2.6各組大鼠海馬組織中NLRP3、Caspase-1、GS-DMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平比較 心梗并焦慮組、心梗組、心梗并焦慮+中藥組大鼠海馬組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，且心梗并焦慮組大鼠海馬組織中NLRP3、Caspase-1、IL-18蛋白表達(dá)水平均明顯高于心梗組(P均<0.05)；心梗并焦慮+中藥組大鼠海馬組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平均明顯低于心梗并焦慮組(P均<0.05)，且NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18蛋白表達(dá)水平均明顯低于心梗組(P均<0.05)。見圖7。

圖7 各組大鼠海馬組織中NLRP3、Caspase1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)情況

3 討 論

慢性空瓶刺激是誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生情緒應(yīng)激的傳統(tǒng)造模方式，也是焦慮模型大鼠的主要造模方法，簡單易形。故本實驗采用空瓶刺激方法進(jìn)行焦慮造模，焦慮造模結(jié)束后采用高架十字迷宮實驗和曠場實驗進(jìn)行行為學(xué)評測，腦部HE及尼氏染色進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果顯示，心梗并焦慮組大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)比例、開放臂停留時間比例、鼠水平運(yùn)動得分和垂直運(yùn)動得分均明顯低于假手術(shù)組和心梗組；腦部HE染色顯示心梗并焦慮組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞發(fā)生核固縮，細(xì)胞數(shù)量減少，排列疏松，海馬尼氏陽性面積減少。提示心肌梗死合并焦慮大鼠處在嚴(yán)重焦慮情緒狀態(tài)中，腦部神經(jīng)元受損嚴(yán)重。

目前研究認(rèn)為炎性反應(yīng)、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)激活和交感神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮等是焦慮心理障礙誘發(fā)并惡化心血管疾病的病理機(jī)制。有研究表明，心肌梗死后機(jī)體處于應(yīng)激性壓力狀態(tài)下，這種應(yīng)激性壓力激活了HPA軸和自主神經(jīng)系統(tǒng)的交感分支(SNS)，伴隨著迷走神經(jīng)張力的降低，這種穩(wěn)態(tài)失衡同時導(dǎo)致了焦慮抑郁的促炎狀態(tài)[11]。SNS刺激導(dǎo)致促炎信號的上調(diào)，而副交感神經(jīng)張力的降低會影響人體的免疫反應(yīng)[12]。焦慮引起的交感神經(jīng)系統(tǒng)及血小板活化是心肌梗死后并發(fā)癥發(fā)生率增高的根本原因[13]。部分實驗研究表明，心肌梗死后誘發(fā)焦慮樣行為可能與小膠質(zhì)細(xì)胞激活，神經(jīng)元凋亡和海馬氧化應(yīng)激增強(qiáng)引起的炎癥反應(yīng)有關(guān)[14]。外周免疫炎性反應(yīng)的激活可通過增加血清素的周轉(zhuǎn)率和氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活HPA軸以及降低突觸可塑性來導(dǎo)致情緒和行為的改變[15]。本實驗結(jié)果顯示，心梗并焦慮組和心梗組大鼠海馬區(qū)NLRP3、Caspase-1、GSDMD表達(dá)IOD值和海馬組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組，且心梗并焦慮組GSDMD表達(dá)IOD值和NLRP3、Caspase-1、IL-18蛋白表達(dá)水平均明顯高于心梗組，提示處于焦慮狀態(tài)下的心肌梗死大鼠海馬區(qū)發(fā)生嚴(yán)重炎性反應(yīng)。

柴胡加龍骨牡蠣湯源于《傷寒論》，方中柴胡疏解少陽之氣郁，黃芩清瀉少陽之郁熱，柴胡和黃芩相伍，可使邪郁得透，氣郁能達(dá)，火郁得清；龍骨、牡蠣、珍珠母(代鉛丹)鎮(zhèn)驚安神定志；茯苓寧心安神；大黃苦寒瀉熱，桂枝溫通經(jīng)絡(luò)合大黃活血通絡(luò)；半夏降逆化痰；人參益氣安神扶正；生姜、大棗健脾益氣，調(diào)和諸藥；全方可安神解郁理氣，有緩解焦慮抑郁作用，在臨床中被廣泛應(yīng)用。本實驗觀察了柴胡加龍骨牡蠣湯對心肌梗死合并焦慮大鼠的影響，結(jié)果顯示，心梗并焦慮+中藥組大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)所占比和開放臂停留時間所占比、大鼠水平運(yùn)動得分和垂直運(yùn)動得分、海馬區(qū)尼氏陽性面積均明顯高于心梗并焦慮組，海馬區(qū)NLRP3、Caspase-1、GSDMD表達(dá)IOD值和NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平均明顯低于心梗并焦慮組。提示柴胡加龍骨牡蠣湯可緩解心肌梗死合并焦慮大鼠的焦慮狀態(tài)，抑制海馬區(qū)細(xì)胞發(fā)生凋亡及炎性因子的釋放。另外本研究超聲心動圖發(fā)現(xiàn)柴胡加龍骨牡蠣湯干預(yù)可改善心肌梗死合并焦慮大鼠的心功能。

綜上所述，柴胡加龍骨牡蠣湯可能通過調(diào)控海馬區(qū)NLRP3/GSDMD炎性信號通路，抑制心肌梗死合并焦慮大鼠海馬區(qū)的炎性反應(yīng)，緩解大鼠焦慮狀態(tài)，且對心功能有一定積極影響，但仍需整合多方面的證據(jù)資料，進(jìn)一步論證柴胡加龍骨牡蠣湯對心肌梗死合并焦慮的干預(yù)效應(yīng)及機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。