楊慧 張佳 劉博文 劉錢(qián) 李松洋 吳磊 徐玉玲 劉濤

摘 要 目的：建立黃連花薹的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并研究其與抗氧化和抑菌作用的譜效關(guān)系。方法：以14批不同產(chǎn)地的黃連花薹為對(duì)象，采用HPLC法測(cè)定。色譜柱為Supersil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為329 nm，進(jìn)樣量為10 μL。采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版）建立14批黃連花薹的指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)和共有峰指認(rèn)。以DPPH自由基清除率和羥自由基清除率為抗氧化作用指標(biāo)，以相對(duì)抑菌活性（大腸埃希菌）為抑菌作用指標(biāo)，利用SPSS 21.0軟件對(duì)黃連花薹共有峰與上述兩種藥效指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，建立譜效關(guān)系模型，并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：黃連花薹的HPLC指紋圖譜中共得到7個(gè)共有峰，相似度均不低于0.916，并指認(rèn)5號(hào)峰為鹽酸小檗堿。7個(gè)共有峰均與DPPH自由基清除率呈正相關(guān);1～3、4、6、7號(hào)峰與羥自由基清除率呈正相關(guān)，5號(hào)峰與羥自由基清除率呈負(fù)相關(guān);5號(hào)峰與相對(duì)抑菌活性呈正相關(guān)。經(jīng)驗(yàn)證，黃連花薹樣品的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、相對(duì)抑菌活性的預(yù)測(cè)值與測(cè)量值的相對(duì)誤差為0.92%～14.5%。結(jié)論：所建立的譜效關(guān)系模型可用于黃連花薹抗氧化、抑菌作用的評(píng)價(jià);1、2、3、4、6、7號(hào)峰所代表化學(xué)成分是黃連花薹抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，鹽酸小檗堿是其抑菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 黃連花薹;高效液相色譜;指紋圖譜;抗氧化作用;抑菌作用;物質(zhì)基礎(chǔ)

中圖分類號(hào) R284.1;R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）05-0559-06

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of Coptis chinensis inflorescence， and study its spectrum-effect relationship with antioxidant and antibacterial effects. METHODS：Taking 14 batches of C. chinensis inflorescence from different producing areas as the object， HPLC method was adopted. The determination was performed on Supersil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 25 ℃. The detection wavelength was set at 329 nm， and sample size was 10 μL. The fingerprints of 14 batches of C. chinensis inflorescence were established by Similarity Evaluation System of TCM Fingerprint （2012 A edition）， and the similarity evaluation and common peak identification were carried out. Taking DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl radical scavenging rate as antioxidant effects index， relative antibacterial activity （Escherichia coli） as antibacterial effect index， SPSS 21.0 software was adopted to analyze the Pearson correlation between common peaks of C. chinensis inflorescence and above efficacy indexes; their spectrum-effect relationship was established and validated. RESULTS：A total of 7 common peaks were obtained in HPLC fingerprint of C. chinensis? inflorescence， and the similarity was no less than 0.916. No. 5 peak was identified as berberine hydrochloride. Seven common peaks were positively correlated with DPPH free radical scavenging rate; No. 1-3， 4， 6， 7 peaks were positively correlated with hydroxyl radical scavenging rate， while No. 5 peak was negatively correlated with hydroxyl radical scavenging rate. There was a positive correlation between No. 5 peak and antibacterial activity in vitro. After validation， relative error between the predicted values and the measured values of DPPH free radical scavenging rate， hydroxyl radical scavenging rate and relative antibacterial activity was 0.92%- 14.5%. CONLUSIONS：The established spectrum-effect relationship model can be used to evaluate antioxidant and antibacterial effects of C. chinensis inflorescence. The chemical components represented by No. 1， 2， 3， 4， 6， 7 peaks are the material basis of antioxidant effect of C. chinensis inflorescence， and berberine hydrochloride is the material basis of antibacterial effect.

KEYWORDS? ?Coptis chinensis inflorescence; HPLC; Fingerprint; Antioxidant activity; Antibacterial activity; Material basis

黃連花薹系毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云連Coptis teeta Wall.所開(kāi)的花。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃連花薹的化學(xué)活性物質(zhì)在體內(nèi)外具有清熱解毒、抗炎、抗病毒、保護(hù)胃腸道、抗腫瘤、降血糖、降血脂、降血壓等藥理作用[1]。屠大偉等[2]測(cè)定黃連花薹的抗氧化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃連花薹水浸出物具有清除羥自由基、超氧自由基和過(guò)氧化氫的能力。相關(guān)研究顯示，黃連花薹中鹽酸小檗堿和黃酮類成分含量較高，其中鹽酸小檗堿具有明顯的抑菌作用[3-4]。但黃連花薹具體是哪種成分發(fā)揮抗氧化、抑菌作用目前尚不明確，基于此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立黃連花薹的指紋圖譜，對(duì)其指紋圖譜中的共有峰與其抗氧化作用和抑菌作用進(jìn)行相關(guān)性分析，建立譜效關(guān)系，以期為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的明確和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：Waters 2695型HPLC儀（美國(guó)Waters公司）、SQP型萬(wàn)分之一電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）、PS-40型超聲波清洗器（深圳市深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司）、TU-1810 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、JJ-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）、DH3006A型電熱恒溫培養(yǎng)箱（西安禾普生物科技有限公司）、XFS-280型手提式壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用黃連花薹采自不同的黃連種植基地（樣品信息見(jiàn)表1），經(jīng)成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院劉濤教授鑒定為毛茛科植物黃連C. chinensis Franch.所開(kāi)的花;其它藥品與試劑有：鹽酸小檗堿對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq18020208，純度≥98%），DPPH（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)201424），阿莫西林膠囊（國(guó)藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司，批號(hào)170616，規(guī)格0.25 g），無(wú)水乙醇、水楊酸、七水硫酸亞鐵、30% H2O2（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)分別為2018071701、2017021001、2019040201、2019032101），牛肉浸膏（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，批號(hào)20160303），蛋白胨、營(yíng)養(yǎng)肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為20181022、20170108），甲醇、乙腈（色譜純），純凈水。

1.3 菌種

本研究所用大腸埃希菌由成都大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Supersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（每1 000 mL中含有20 μL三乙胺，B），梯度洗脫（0～18 min，18%A→21%A;18～40 min，21%A→27%A;40～58 min，27%A→60%A;58～65 min，60%A→18%A;65～70 min，18%A）;流速為1.0 mL/min;柱溫為25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為329 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取黃連花薹粉末（過(guò)二號(hào)篩，下同）0.2 g置于錐形瓶?jī)?nèi)，精密加入甲醇24.6 mL、鹽酸0.4 mL，搖勻，稱定質(zhì)量，靜置12 h后，超聲（頻率40 kHz ，功率240 W，下同）30 min后冷卻至室溫，以甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液適量，經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.037 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取黃連花薹粉末（編號(hào)S1）適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。以5號(hào)峰（鹽酸小檗堿，因其峰分離度良好、峰面積大且穩(wěn)定，故以其峰面積為參照）的峰面積和保留時(shí)間為參照，記錄各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果，7個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于4.0%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取黃連花薹粉末（編號(hào)S1）適量，共6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以5號(hào)峰的峰面積和保留時(shí)間為參照，記錄各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果，7個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.5%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取黃連花薹粉末（編號(hào)S1）適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、24 h后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以5號(hào)峰的峰面積和保留時(shí)間為參照，記錄各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果，7個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于7.0%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.5%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 黃連花薹HPLC指紋圖譜的生成、相似度評(píng)價(jià)和共有峰指認(rèn)

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取14批黃連花薹粉末適量，分別按“2.2.1”方法制備供試品溶液，再按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)14批黃連花薹樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析，得黃連花薹樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜（R）和疊加指紋譜圖，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，14批黃連花薹樣品的相似度均不低于0.916，提示不同產(chǎn)地的黃連花薹樣品間的化學(xué)成分差異較小，詳見(jiàn)表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn) 以14批黃連花薹的HPLC指紋圖譜為研究對(duì)象，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件，設(shè)置時(shí)間窗口為0.1 min，選擇指紋圖譜中峰形較好的色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，可知其共有7個(gè)共有峰;結(jié)合對(duì)照品的HPLC圖譜，指認(rèn)出5號(hào)峰為鹽酸小檗堿，詳見(jiàn)圖3。以鹽酸小檗堿峰面積為參照，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見(jiàn)表3、表4。

2.5 黃連花薹抗氧化作用考察

2.5.1 DPPH自由基清除率測(cè)定 精密稱取黃連花薹粉末0.12 g于錐形瓶?jī)?nèi)，精密加入水100 mL，超聲提取30 min后，冷卻至室溫，快速濾過(guò);取其續(xù)濾液3.3 mL于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的樣品溶液。精密移取樣品溶液2 mL和DPPH溶液2 mL于25 mL比色管中避光反應(yīng)20 min后，采用紫外分光光度計(jì)于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)i;另移取樣品溶液2 mL和水2 mL于25 mL比色管中避光反應(yīng)20 min，于相同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)j;另移取DPPH溶液2 mL與水2 mL于25 mL比色管中避光反應(yīng)20 min，于相同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)c。上述試驗(yàn)平行操作3次，取平均值，并計(jì)算DPPH自由基清除率，DPPH清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。根據(jù)文獻(xiàn)[5]方法，對(duì)DPPH自由基清除率結(jié)果進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5.2 羥自由基清除率測(cè)定 精密稱取黃連花薹粉末0.12 g于錐形瓶?jī)?nèi)，按“2.5.1”項(xiàng)下“精密量取水100 mL……0.4 mg/mL樣品溶液”方法操作，然后移取樣品溶液2 mL和6 mmol/L FeSO4溶液2 mL于25 mL比色管中，加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻后靜置10 min，加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻后靜置30 min，采用紫外分光光度計(jì)于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)i;另移取6 mmol/L FeSO4溶液2 mL和水2 mL于25 mL比色管中，加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻后靜置10 min，加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻后靜置30 min，于上述相同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)0;另移取樣品溶液2 mL和6 mmol/L FeSO4溶液2 mL于25 mL比色管中，加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻后靜置10 min，加入無(wú)水乙醇溶液2 mL，搖勻后靜置30 min，于上述相同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)j。上述試驗(yàn)平行操作3次，取平均值，并計(jì)算羥自由基清除率，羥自由基清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。根據(jù)文獻(xiàn)[5]方法，對(duì)黃連花薹羥自由基清除率結(jié)果進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)IC50，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.6 黃連花薹抑菌作用考察

2.6.1 供試品溶液的制備 精密稱定黃連花薹粉末適量于錐形瓶?jī)?nèi)，加水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min后冷卻至室溫，濾過(guò);再加水50 mL于殘?jiān)?，超?0 min，過(guò)濾;合并2次濾液，冷凍12 h后，進(jìn)行干燥，即得黃連花薹浸膏。臨用時(shí)，取浸膏適量置于10 mL量瓶中，以水稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.6.2 細(xì)菌培養(yǎng) 取大腸埃希菌菌種適量加入無(wú)菌水中搖勻，涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，于37 ℃培養(yǎng)24 h后備用。

2.6.3 抑菌試驗(yàn) 精密稱取黃連花薹粉末4.0 g，按“2.6.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取“2.6.2”項(xiàng)下大腸埃希菌以水調(diào)整成密度為1×108個(gè)/mL的菌懸液，涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，采用牛津杯法[6]分別將黃連花薹浸膏供試品溶液、0.90 mg/mL阿莫西林溶液（陽(yáng)性對(duì)照）、水（空白對(duì)照）各80 μL點(diǎn)樣于同一平板，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定抑菌圈橫豎直徑，計(jì)算抑菌圈面積大小及相對(duì)抑菌活性（相對(duì)抑菌活性=黃連花薹樣品抑菌圈面積×0.9/阿莫西林抑菌圈面積×100%），結(jié)果見(jiàn)表6。

2.7 黃連花薹譜效關(guān)系分析

以14批黃連花薹藥材樣品的抗氧化活性指標(biāo)（DPPH自由基清除率和羥自由基清除率，見(jiàn)表5）和相對(duì)抑菌活性（見(jiàn)表6）為因變量，HPLC指紋圖譜共有峰峰面積為自變量，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果表明，黃連花薹樣品HPLC指紋圖譜中的7個(gè)共有峰與DPPH自由基清除率呈正相關(guān);1、2、3、4、6、7號(hào)峰與羥自由基清除率呈正相關(guān)，5號(hào)峰與羥自由基清除率呈負(fù)相關(guān);5號(hào)峰與相對(duì)抑菌活性呈正相關(guān)。這提示1、2、3、4、6、7號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分是黃連花薹清除DPPH和羥自由基的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，5號(hào)峰對(duì)應(yīng)的鹽酸小檗堿是黃連花薹抗菌作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，詳見(jiàn)表7、表8。

2.8 譜效關(guān)系模型的構(gòu)建

參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行模型構(gòu)建，采用SPSS 21.0軟件中“Regression”下的“Linear”選項(xiàng)，以黃連花薹共有峰峰面積為X，分別以DPPH清除率、羥自由基清除率、相對(duì)抑菌活性為Y，采用多重線性回歸建立譜效關(guān)系模型。結(jié)果，回歸方程分別為YDPPH自由基清除率=-（6.568×2.72-7）X峰1+ （1.660×2.72-7）X峰2-（8.565×2.72-7）X峰3+（3.838×2.72-7）X峰4-（1.780×2.72-7）X峰5+（4.959×2.72-? ?8）X峰6+（2.211×2.72-7）X峰7+0.989;Y羥自由基清除率=-（5.781×2.72-7）X峰1-（5.246×2.72-8）X峰2+（8.075×2.72-7）X峰3-（2.474×2.72-7）X峰4+（1.454×2.72-? ?7）X峰5-（2.443×2.72-8）X峰6-（7.071×2.72-8）X峰7-0.025;Y相對(duì)抑菌活性=（4.820×2.72-7）X峰1+（3.184×2.72-8）X峰2-（6.107×2.72-7）X峰3+（5.287×2.72-7）X峰4-（9.272×2.72-8）X峰5-（1.751×2.72-8）X峰6-（5.162×2.72-8）X峰7+0.523。

2.9 黃連花薹譜效關(guān)系模型的驗(yàn)證

另取7批黃連花薹粉末（編號(hào)S1、S3、S4、S5、S9、S11、S14），分別測(cè)定各批次樣品的共有峰峰面積、DPPH清除率、羥自由基清除率、相對(duì)抑菌活性后，將這7批樣品的共有峰峰面積代入“2.8”項(xiàng)下回歸方程中，即得Y的預(yù)測(cè)值，并將其與測(cè)量值進(jìn)行比較。結(jié)果，黃連花薹樣品DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、相對(duì)抑菌活性的預(yù)測(cè)值與測(cè)量值的相對(duì)誤差為0.92%～14.5%，表明所建立的譜效關(guān)系模型可用于黃連花薹抗氧化作用、抗菌作用的預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)，詳見(jiàn)表9。

3 討論

目前，中藥質(zhì)量控制方法多以化學(xué)成分的定性和定量分析為主，包括HPLC指紋圖譜在內(nèi)的多種分析方法已被廣泛地應(yīng)用于中藥整體質(zhì)量控制中，其中指紋圖譜包括相似度、相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積以及共有峰和非共有峰的數(shù)量等，但是這些指標(biāo)僅能間接地控制藥材的質(zhì)量，不能明確控制其與臨床藥效的相關(guān)性[8]。

本研究以不同產(chǎn)地的黃連花薹作為研究對(duì)象，采用HPLC法建立指紋圖譜，并以抗氧化作用（DPPH自由基清除率和羥自由基清除率）及抑菌作用作為藥效指標(biāo)，將黃連花薹樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)和藥效指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行譜效關(guān)系分析。結(jié)果，共確定7個(gè)共有峰，并指認(rèn)5號(hào)峰為鹽酸小檗堿;經(jīng)相關(guān)性分析后，發(fā)現(xiàn)1、2、3、4、6、7號(hào)峰與抗氧化活性具有相關(guān)性，鹽酸小檗堿與抑菌活性具有相關(guān)性，且與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。經(jīng)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的相對(duì)誤差未超過(guò)15%，表明本研究建立的譜-效關(guān)系模型可較好地預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)黃連花薹的抗氧化、抑菌作用。

綜上所述，本研究建立的譜-效相關(guān)性模型可用于預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)黃連花薹的抗氧化、抑菌作用，1、2、3、4、6、7號(hào)峰所代表化學(xué)成分是黃連花薹抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，鹽酸小檗堿是其抑菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-09-15 修回日期：2021-01-16）

（編輯：唐曉蓮）