李 昶，劉莎莎

(湖南婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南婁底 417000)

兔的腹瀉病是臨床中常見疾病之一，引起兔腹瀉的因素很多，病原性因素主要有病毒、細(xì)菌、寄生蟲、附紅細(xì)胞體等多種病原，還有飼養(yǎng)管理不當(dāng)、衛(wèi)生條件差、飼料突變等非病原性因素。相關(guān)研究表明病原性因素引起的腹瀉發(fā)病率和死亡率均較高，其病死亡率高達(dá)70%以上，成為危害兔養(yǎng)殖業(yè)主要疾病之一[1-3]。引起幼兔腹瀉的病原菌主要有大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌等，這些病原菌一旦引起發(fā)病，可以波及全群[4]。因此，在家兔養(yǎng)殖中應(yīng)該重視腹瀉性疾病的防控，同時(shí)還要注意環(huán)境衛(wèi)生與定期消毒，減少該病的發(fā)生與流行。本研究采集發(fā)生腹瀉的家兔肛拭子、糞便120份病料進(jìn)行病原菌分離鑒定，并對(duì)病原菌致病性和耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2018年-2019年，采集婁底地區(qū)發(fā)生腹瀉的家兔肛拭子、糞便203份。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖膠回收試劑盒、2×TaqMarker Mix，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，北京中科瑞泰生物公司產(chǎn)品；含卡那霉素、卵黃的CW瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、大腸埃希氏菌顯色鑒別培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、70 mL/L綿羊血培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、厭氣肉肝湯培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，青島海博生物有限責(zé)任公司產(chǎn)品；腸科桿菌生化鑒定試條、藥敏紙片，杭州微生物試劑公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082),上海鰲珍儀器制造有限公司產(chǎn)品；PCR儀(G5100-6400),美國(guó)Agilent Technologie公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(GelDocXR+),美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀(JY600)，北京君意電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)，法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 25 g±2.2 g昆明系小鼠290只，臨床健康，由遵義市實(shí)驗(yàn)小鼠養(yǎng)殖基地提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng) 取采集的病料精處理后，一組接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中增菌，37℃恒溫箱12 h～18 h后，分別接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、70 mL/L綿羊血培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；另一組接種于接種厭氣肉肝湯增菌培養(yǎng)，37℃厭氧12 h～24 h后，接種于含卡那霉素、卵黃的CW瓊脂培養(yǎng)基中厭氧過夜培養(yǎng)。取純化培養(yǎng)的分離菌株涂片染色。

1.2.2 生化試驗(yàn)鑒定 按照細(xì)菌微量生化鑒定管說明書，將菌液接種微量生化鑒定管中培養(yǎng)12 h～24 h，進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。

1.2.3 PCR檢測(cè)與測(cè)序 參照文獻(xiàn)[5-6]，根據(jù)大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌保守區(qū)基因序列設(shè)計(jì)特異鑒定引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮方法提取分離菌株基因組DNA，用6種特異性引起進(jìn)行PCR檢測(cè)，其 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果NCBI中Blast比對(duì)分析其同源性。

表1引物序列

1.2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7-8]，將分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度1×108CFU/mL，每株分離菌株灌胃攻毒5只小鼠，劑量為0.2 mL，對(duì)照組給予PBS。攻毒12 h后，觀察7 d，并記錄攻毒組小鼠的發(fā)病與死亡情況，并進(jìn)行病原菌鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 參照用美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)KB紙片法進(jìn)行，按照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進(jìn)行結(jié)果判斷，分析耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

疑似大腸埃希氏菌在大腸埃希氏菌顯色鑒別培養(yǎng)基長(zhǎng)出圓形的、大小一致的綠色的菌落，染色鏡檢呈兩端鈍圓桿狀陰性菌。疑似銅綠假單胞菌在MH培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形的、大小一致菌落，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)呈現(xiàn)綠色，染色鏡檢呈兩端略圓的短桿狀陰性菌；疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌在含卡那霉素、卵黃的CW瓊脂培養(yǎng)基長(zhǎng)出圓形、卵黃色、周圍形成白濁環(huán)菌落，染色鏡檢呈兩端鈍圓、無到芽孢粗桿狀陽性菌；疑似金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出邊緣整齊的淺黃色菌落，在70 mL/L羊血培養(yǎng)基呈現(xiàn)β溶血，染色鏡檢呈單個(gè)短鏈和成串狀陽性球菌；

2.2 生化鑒定結(jié)果

分離的20株分離菌株均能發(fā)酵枸櫞酸鹽、葡萄糖、麥芽糖；吲哚試驗(yàn)呈陰性，鑒定為銅綠假單胞菌；分離的17株分離菌株發(fā)酵為麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、硝酸鹽還原為陽性，甘露醇、吲哚為陰性，鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌；分離的15株菌株能分解葡萄糖、甘露糖、蔗糖、且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解纖維二糖、阿拉伯糖、七葉苷，靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性；V-P試驗(yàn)和過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，鑒定為金黃色葡萄球菌；分離的30株均能分解甘露醇、葡萄糖、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，V-P試驗(yàn)呈陰性、吲哚和甲基紅反應(yīng)為陽性，鑒定為大腸埃希氏菌。

2.3 細(xì)菌PCR檢測(cè)與測(cè)序結(jié)果

分離菌株用大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌特異性引物各自擴(kuò)增出約為1 043、200、324、609 bp的目的基因條帶，未擴(kuò)增出沙門氏菌、志賀氏菌目的基因條帶(圖1)；大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌4種病原菌PCR產(chǎn)物的側(cè)序結(jié)果與GenBank庫中登錄參考株基因序列同源性均大于97.9%。從分子生物學(xué)角度證實(shí)從203份病料組織中分離得到了20株銅綠假單胞菌、17株產(chǎn)氣莢膜梭菌、15株金黃色葡萄球菌、30株大腸埃希氏菌。

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果

在攻毒后的2 d～4 d，攻毒組小鼠精神沉郁，采食量減少，腹瀉，部分小鼠肚子鼓脹，有的小鼠無明顯臨床癥狀死亡，從死亡的小鼠體內(nèi)分離到銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌4種病原菌，試驗(yàn)結(jié)束(7 d)，對(duì)照組的小鼠健康存活。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，分離得到20株大腸埃希氏菌、15株銅綠假單胞菌、12株產(chǎn)氣莢膜梭菌、10株金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠具有致病性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.空白對(duì)照；2.志賀氏菌；3.沙門氏菌；4.金黃色葡萄球;5.銅綠假單胞菌;6.產(chǎn)氣莢膜梭菌;7.大腸埃希氏菌

2.5 耐藥性分析結(jié)果

分離的15株致病性銅綠假單胞菌對(duì)阿莫西林、氨曲南、慶大霉素、大觀霉素、林可霉素、強(qiáng)力霉素、磺胺嘧啶7種藥物耐藥率為46.7%～100%，對(duì)其他藥物耐藥率在20.0%～40.0%；分離的12株致病性產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)環(huán)丙沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考、慶大霉素、大觀霉素、林可霉素、多粘菌素、強(qiáng)力霉素8種藥物耐藥率為41.7%～100%，對(duì)其他藥物耐藥率為8.3%～33.3%；分離的10株致病性金黃色葡萄球菌對(duì)磺胺嘧啶、氟苯尼考、慶大霉素、大觀霉素、林可霉素、多粘菌素、強(qiáng)力霉素7種藥物80.0%～100%，對(duì)其他藥物耐藥率在10.0%～40.0%；分離的20株大腸埃希氏菌對(duì)磺胺嘧啶、多黏菌素、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、氨曲南、氟苯尼考、慶大霉素、大觀霉素7種藥物45.0%～100%，對(duì)其他藥物耐藥率在10.0%～40.0%(表2)。

表2耐藥性分析結(jié)果

3 討論

家兔養(yǎng)殖過程中，飼養(yǎng)管理不當(dāng)或者外界條件發(fā)生改變時(shí)，家兔免疫力下降，其感染病原菌幾率會(huì)顯著增加，當(dāng)家兔感染病原菌后出現(xiàn)消化道、呼吸道等疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，兔細(xì)菌性疾病成為危害養(yǎng)兔業(yè)主要疾病之一[2-4]。兔細(xì)菌性腹瀉發(fā)病率和病死率均較高，且發(fā)病無明顯的季節(jié)性，以冬春季節(jié)最易流行，引起兔腹瀉病原菌種類比較多，具有多樣性[9-10]。相關(guān)研究表明腹瀉對(duì)幼兔危害比較大，病死率可達(dá)50%～70%[11]。因此，在家兔養(yǎng)殖過程中應(yīng)該注意兔腹瀉的防控。本試驗(yàn)采集的發(fā)生腹瀉病兔肛拭子、糞便等病料120份中分離得到20株銅綠假單胞菌、17株產(chǎn)氣莢膜梭菌、15株金黃色葡萄球菌、30株大腸埃希氏菌。通過人工感染小鼠驗(yàn)證其分離菌株的致病性，結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)小鼠具有致病性，從而證實(shí)了4種病原微生物可能是引起實(shí)驗(yàn)家兔腹瀉主要病原菌。許國(guó)洋等[6]研究表明重慶地區(qū)引起兔腹瀉的病原菌主要有產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌等，且存在混合感染。大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌均是人畜共患的條件致病菌，廣泛存在養(yǎng)殖環(huán)境中，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體免疫力下降時(shí)，均可以引起發(fā)病[12]。因此，在兔養(yǎng)殖過程中應(yīng)該注重相關(guān)細(xì)菌性疾病防控及環(huán)境衛(wèi)生與消毒，同時(shí)加強(qiáng)平時(shí)飼養(yǎng)管理，減少應(yīng)激反應(yīng)。

由于引起兔腹瀉的病原菌比較復(fù)雜，給疫苗的研制帶有較大困難，因此，抗菌藥物成為控制兔腹瀉病的主要手段之一。相關(guān)研究表明在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中，不合理的使用抗菌藥物，致使沙門氏菌、大腸埃希氏菌、葡萄球菌、鏈球菌等多種致病菌均對(duì)抗菌產(chǎn)生具有很強(qiáng)的耐藥性，且出現(xiàn)多重耐藥性。同時(shí)病原菌產(chǎn)生的耐藥性可以通過多種途徑傳播給人類[13]。本試驗(yàn)研究，分離的15株致病性銅綠假單胞菌對(duì)阿莫西林、氨曲南、慶大霉素等7種藥物耐藥率在46.7%以上，分離的12株致病性產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)環(huán)丙沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考等8種藥物耐藥率在41.7%以上，分離的10株致病性金黃色葡萄球菌對(duì)磺胺嘧啶、氟苯尼考、慶大霉素等7種藥物耐藥率在80.0%以上，分離的20株大腸埃希氏菌對(duì)磺胺嘧啶、多黏菌素、強(qiáng)力霉素等7種藥物耐藥率在45.0%以上，4種病原菌對(duì)其他藥物具有不同的耐藥性。說明從患腹瀉病的兔分離的病原菌具有很強(qiáng)的耐藥性，應(yīng)該注重抗菌藥物的合理使用，減少耐藥性產(chǎn)生。本研究為兔腹瀉病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。