佟盼盼，張 磊，宋小珍，任美靈，賈陳陽，帕麗旦·努爾蘭，譚美玲，況 玲，謝金鑫

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

在馬屬動物中迄今已鑒定出9種皰疹病毒(Equid herpesvirus，EHV)，即EHV-1～EHV-9，其中EHV-1、-3、-4、-6、-8、-9屬于α-皰疹病毒亞科，EHV-2、-5、-7屬于γ-皰疹病毒亞科[1]。馬是EHV-1、-2、-3、-4、-5的自然宿主[1]。EHV-5可導致馬呼吸道疾病，表現(xiàn)為咽炎、有鼻和眼分泌物、呼吸急促、咳嗽、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、食欲減退等，呈地方性散發(fā)感染，在患馬的鼻腔分泌物、外周血單核細胞以及淋巴器官中可檢測到該病毒[2-7]。近年來已有多個國家和地區(qū)報道了EHV-5在馬上的流行情況，但對該病毒的發(fā)病機制了解較少，缺乏對該病毒引起疾病的有效治療方法[2-7]。我國對EHVs研究僅限于EHV-1和EHV-8[8-9]，尚缺少對EHV-5流行現(xiàn)狀的報道及相應的檢測方法。

gH糖蛋白的分子質(zhì)量大小約55 ku，由498個氨基酸的多肽組成，共有11個糖基化的潛在位點與其N端連接，目前是病毒融合蛋白中唯一呈現(xiàn)出經(jīng)典結(jié)構(gòu)的糖蛋白，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體是EHV-5中具有重要意義的囊膜蛋白[10]。本研究首次在國內(nèi)馬匹鼻拭子樣品中檢測到EHV-5，并對病毒gH基因進行同源性和遺傳進化分析，可為EHV-5的流行病學研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 本實驗室于2018年從新疆烏魯木齊某馬術(shù)俱樂部采集226匹臨床健康純血馬鼻拭子樣品。

1.1.2 主要試劑 Viral Nucleic Acid Extraction Kit，旭基生物科技有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、Reverse Transcriptase M-MLV、Klenow Fragment、Ribonuclease H、ExTaq，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2.3 主要儀器設備 普通PCR儀和5415 R冷凍型離心機，Eppendorf公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；OptimaTMMAX-TL臺式超速離心機，Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 宏病毒組學分析 參考本實驗室建立的宏病毒組學樣品處理方法[11]，對馬呼吸道樣品進行處理。將隨機擴增獲得的DNA通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化，合格后送上海派森諾生物技術(shù)股份有限公司進行高通量測序(Illumina HiSeq X-ten)。

1.2.2 引物 參照GenBank中EHV-5參考毒株(登錄號：KM924295)gH基因序列，使用Primer 5.0軟件設計gH基因特異性引物，上游：5′-CAAGATGGTGGAGTTTGAGGTTACT-3′；下游：5′-GTTAGAAACCAGCTTGCTTTCAGAG-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR體系及程序 按照Geneaid試劑盒說明書的步驟，提取馬鼻拭子的病毒DNA。以馬鼻拭子病毒DNA為模板，擴增gH基因，體系如下：ExTaq0.125 μL，dNTPs 0.8 μL，10×ExTaqbuffer 2 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補齊至25 μL。反應條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，共34個循環(huán)；72℃終末延伸10 min。通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測特征性條帶，將擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行Sanger測序。

1.2.4 gH基因的同源性及其氨基酸序列遺傳進化分析 根據(jù)GenBank中登錄的相關(guān)EHV-5 gH序列，采用DNAstar軟件對獲得的EHV-5 gH基因核苷酸和氨基酸序列與EHV-5 gH基因核苷酸和氨基酸序列進行同源性分析。用MEGA7.0.26軟件采用最大似然法構(gòu)建gH氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，步展值重復1 000次進行評估。

2 結(jié)果

2.1 宏病毒組學分析

宏病毒組學分析共產(chǎn)生73 664 946條reads，有16 067條reads (0.022%)注釋為哺乳動物病毒(皰疹病毒、副流感病毒、痘病毒、細小病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和小雙節(jié)RNA病毒等16個病毒科)，其中有105條reads注釋到EHV-5 gH基因，核苷酸同源性為96.8%～100%，讀長150 nt。

2.2 PCR檢測結(jié)果及gH基因序列測定

通過特異性PCR檢測，在226份鼻拭子樣品中有14份顯EHV-5陽性，陽性率為6.2%(14/226)，部分純血馬鼻拭子樣品EHV-5 gH基因的PCR擴增結(jié)果見圖1；14株病毒gH基因核苷酸序列提交至GenBank，獲得登錄號為MT547931-MT547944。

2.3 gH基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析

用MegAlign軟件將本研究鑒定的14株EHV-5(9817、HB、9060、7917、7691、7689、1003、1364、4445、7446、7448、7683、1482和1495株)gH基因的核苷酸和氨基酸序列與GenBank登錄的5條EHV-5 gH基因核苷酸和氨基酸序列比對分析結(jié)果顯示，14株gH基因核苷酸和氨基酸序列與澳大利亞(EHV-5.2-141和2-141/67株)、意大利(glycoprotein H株)及日本(16-I-1064和1-I-790株)的EHV-5 gH基因核苷酸和氨基酸同源性為98.4%～100%和90.3%～100%(表1)。

M.DNA標準DL 2 000; 1～5、7～8、10～12.陽性樣品; 6、9.陰性樣品

2.4 EHV-5 gH氨基酸序列遺傳進化樹分析

以上述5株EHV-5為參考株，用MEGA7.0.26軟件構(gòu)建gH氨基酸序列進化樹,結(jié)果14株我國EHV-5 gH基因與澳大利亞2-141/67和EHV-5.2-141參考株處于同一進化分支，親緣關(guān)系較近，但與意大利的glycoprotein H株和日本16-I-1064和1-I-790株處于不同分支(圖2)。

3 討論

宏病毒組學能夠克服傳統(tǒng)實驗室檢測方法的局限性，實現(xiàn)病原的高精度識別，其依托高通量測序，能夠快速準確的鑒定出樣品中所有的病毒組成，在病毒發(fā)現(xiàn)、病毒溯源、傳染病和流行病學預警等研究方面具有重要作用[12]。本研究將宏病毒組學方法用于烏魯木齊市純血馬呼吸道樣品攜帶病毒多樣性研究，首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了EHV-5，表明該病毒存在于國內(nèi)馬群中。

EHV-5感染引起的呼吸道疾病嚴重危害全世界馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本研究顯示烏魯木齊市某馬場純血馬EHV-5陽性率為6.2%(14/226)，在全球馬匹EHV-5陽性率(2.3%～74%)的范圍內(nèi)[2-7]，提示還需要擴大調(diào)查范圍，進而掌握新疆地區(qū)EHV-5流行趨勢和特征。

本研究鑒定的14株EHV-5 gH基因的核苷酸同源性為98.2%～100%，氨基酸同源性為95.3%～100%，表明烏魯木齊市馬場EHV-5為低變異毒株。已有報道顯示多數(shù)情況下鼻拭子樣品中能同時檢測到EHV-5和EHV-2[2-7]。本研究在226匹純血馬鼻拭子樣品中未檢測到EHV-2，表明該馬術(shù)俱樂部純血馬為EHV-5單一感染。

表1EHV-5的核苷酸(右上)和氨基酸(左下)同源(%)

●代表本研究發(fā)現(xiàn)的毒株。

為了更好地改良本土馬匹品種，近幾年我國從澳大利亞、愛爾蘭、日本等多個國家引進純血馬。我國海關(guān)對進口馬的檢測項有EHV-1、非洲馬瘟病毒等[13]，但目前并未將EHV-5檢測納入其中。本研究中純血馬馬術(shù)俱樂部無本土馬飼養(yǎng)史,研究結(jié)果提示純血馬在入境、疆內(nèi)運輸和入場前需要酌情考慮增加EHV-5檢測項，以防范EHV-5在我國馬群中擴散，規(guī)避EHV-5感染引起的經(jīng)濟損失。