黃賢能，萬 鵬，趙瑞芝，胡巧紅*

(1.廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006)

柴胡為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC)或狹葉柴胡的干燥根，分別習(xí)稱為“北柴胡”及“南柴胡”，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明柴胡具有解熱鎮(zhèn)痛、保肝、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)儭⒖拱┑榷喾N藥理作用[2-4]。柴胡的主要成分包括皂苷、揮發(fā)油以及多糖[5-6]。柴胡多糖具有抗炎、增強免疫功能和抗腫瘤等活性[7-8]。醋炙是柴胡的常見炮制方法，而柴胡醋炙后，柴胡多糖是否具有抗炎活性，目前鮮有報道。本研究通過脫脂、水提醇沉、脫蛋白和陰離子交換柱層析等方法對醋柴胡多糖進行分離純化獲得精制多糖并用LPS誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7制備細胞炎癥模型，探討醋柴胡多糖對LPS 誘導(dǎo)的細胞炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 醋柴胡(產(chǎn)地為湖北，批號：201706)，經(jīng)廣東省中醫(yī)院陳文良藥師鑒定為傘形科植物北柴胡干燥根醋制品,康美藥業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑 乙酸酐(批號：20131102),廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸羥胺(批號：H811236),廣州菲博生物有限公司；DEAE-FF瓊脂糖凝膠(批號：R16F8D29299),上海源葉生物有限公司； Dextran 855K、Dextran 215K、Dextran 130K、Dextran 60K、Dextran 40K、Dextran 18K(批號分別為：230-F、91418、98841、40KA、R4、95F),北京綠百草有限公司；甘露糖(批號：AA0416LA13)、鼠李糖(批號：S29D5G1)、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號：AJ0702FA14)、巖藻糖(批號：A31M7L155555；)、D-無水葡萄糖(批號：Y01D5Y3)、木糖(批號：B02M6W1)、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號：YM0506YA14)均為上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%；地塞米松磷酸鈉注射液(DXMS，國藥準(zhǔn)字12020515)，天津金耀集團湖北天藥藥業(yè)股份有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基(批號：20171014)，Gibco公司；MTT試劑(批號：DH343-1)，廣州威佳生物有限公司；二甲基亞砜(CP，批號：201703)，廣州化學(xué)試劑廠；一氧化氮試劑盒(批號：S0021)，碧云天生物科技有限公司。

1.1.3 細胞 小鼠腹腔巨噬細胞RAW 264.7，購于上海ATCC細胞庫。

1.1.4 主要儀器 氣相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀(7890A/5975C)，美國安捷倫公司；高效液相色譜儀(1260)，美國安捷倫公司；傅里葉變換紅外光譜儀(Vector 33)，德國Bruck公司 ；紫外分光光度計(UV-2900)，日本日立公司；酶標(biāo)儀(VICTOR X5型)PerkinElmer公司；倒置顯微鏡(CKX41)，日本Olympus公司；自動細胞計數(shù)儀(ZC-1000)，上海睿鈺生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 醋柴胡多糖的提取純化

1.2.1.1 醋柴胡總多糖的提取和分離 根據(jù)文獻工藝進行多糖提取和分離[9]。8 kg醋柴胡藥材用700 mL/L乙醇冷浸過夜后，用5倍體積的700 mL/L乙醇加熱回流提取4次，過濾。藥渣用10倍體積水回流提取3次，過濾，減壓濃縮至相當(dāng)于生藥量1 mg/mL，得醋柴胡水提液。醋柴胡水提液中加入乙醇，調(diào)節(jié)含醇量為80%，于4℃靜置過夜。抽濾，收集沉淀，凍干得醋柴胡粗多糖。將醋柴胡粗多糖用Sevage法脫蛋白7次，減壓濃縮除去有機溶劑后再次調(diào)節(jié)含醇量為80%，離心后收集沉淀，凍干得到醋柴胡總多糖。

1.2.1.2 醋柴胡精多糖的制備 稱取800 mg醋柴胡總多糖，溶于20 mL純水。以DEAE瓊脂糖凝膠Fast flow離子交換層析柱(26×800 mm)進行分離純化。分別用水、0.05、0.1、0.2、0.4、1 mol/L的NaCl溶液和0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液以3 mL/min進行洗脫，每管收集10 mL，以苯酚硫酸法進行隔管檢測，作出洗脫曲線，收集0.2 mol/L NaCl溶液洗脫組分，減壓濃縮，透析72 h后凍干，得到醋柴胡精多糖，命名為VBCP-3。

1.2.2 醋柴胡多糖VBCP-3的結(jié)構(gòu)分析

1.2.2.1 VBCP-3的紫外光譜掃描 精密稱取VBCP-3 5 mg，用超純水配制為500 mg/L溶液。以超純水為空白對照，利用紫外分光光度計在190 nm～550 nm范圍進行全波長掃描。

1.2.2.2 VBCP-3的純度與分子量測定 以葡聚糖D18K、D40K、D60K、D130K、D215K、D855K為標(biāo)準(zhǔn)品，分別將不同質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和VBCP-3配制成 2.0 mg/mL的溶液，過0.22 μm濾膜，以安捷倫高效液相1260檢測。色譜柱為TSK G-4000PWXL，進樣量為 20 μL，流動相為超純水，流速為0.5 mL/min，柱溫40℃，檢測器為示差折光檢測器，檢測器溫度為40℃。記錄色譜圖和保留時間，用標(biāo)準(zhǔn)品葡聚糖相對分子質(zhì)量的對數(shù)lg(Mw)對保留時間作圖，得到葡聚糖相對分子量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)方程，通過相對分子量方程計算VBCP-3的分子質(zhì)量。

1.2.2.3 VBCP-3的紅外光譜分析 稱取VBCP-3 2 mg，干燥條件下壓成薄片，于500 cm-1～4 000 cm-1進行常規(guī)IR分析。

1.2.2.4 VBCP-3的單糖組成分析 稱取VBCP-3 10 mg，加入2 mol/L的三氟乙酸溶液4 mL，110℃加熱6 h，將水解樣品于50℃減壓濃縮蒸干，加入適量體積甲醇重復(fù)減壓濃縮，去除殘留的三氟乙酸。

取 10 mg VBCP-3水解產(chǎn)物，加入10 mg鹽酸羥胺、1 mL吡啶，于 90℃水浴加熱30 min，加入乙酸酐1 mL，再于90℃繼續(xù)水浴加熱30 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜后進行 GC-MS分析，與標(biāo)準(zhǔn)單糖比對分析單糖組成及比例。

色譜條件：Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；Agilent HP-5MS毛細管柱(0.25 μm×250 μm，30 m)；汽化室溫度 250℃，檢測器溫度 250℃，柱溫 150℃；程序升溫：150℃(2 min)→200℃(3 min)→250℃(10 min)；載氣流速：1 mL/min；吹掃：4.0 mL/min。

1.2.3 醋柴胡多糖VBCP-3的抗炎活性

1.2.3.1 RAW 264.7細胞培養(yǎng) 小鼠腹腔巨噬細胞(RAW 264.7)復(fù)蘇，加入完全培養(yǎng)基離心棄上清之后，再次加入新的完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打，分別加入到2個培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿再次加入5 mL完全培養(yǎng)基，然后置于37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.3.2 VBCP-3對細胞存活率的影響 將細胞RAW264.7接種于96孔板上(200 μL/孔)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，加入200 μL含不同濃度VBCP-3的細胞培養(yǎng)液(VBCP-3濃度分別為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 mg/L)。24 h后取出，用MTT法測定各組的細胞存活率。細胞存活率(%)=給藥組平均吸光度/空白對照組平均吸光度×100%

1.2.3.3 VBCP-3對巨噬細胞產(chǎn)生NO的影響 將3×105個/mL RAW264.7細胞加入24孔板(1 mL/孔)，培養(yǎng)24 h后，棄去上清，分為空白培養(yǎng)液組、LPS組(1 mg/L LPS)、陽性藥物組(1 mg/L LPS+50 mg/L地塞米松)、VBCP-3組(1 mg/L LPS+(7.8～125) mg/L VBCP-3溶液)，每組加入對應(yīng)的供試液(或空白培養(yǎng)液)1 mL。培養(yǎng)24 h后，按照試劑盒說明操作。將1 mol/L NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成0、1.62、3.12、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的NaNO2溶液，然后取50 μL不同濃度的NaNO2稀釋液，置于96孔板上，加入50 μL試劑1，再加入50 μL試劑2，放置5 min后，用酶標(biāo)儀測定540 nm處的吸光度并做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。給藥樣品取上清液50 μL，按照上述方法測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中NO的含量。NO抑制率(%)=(1-給藥組NO含量/LPS組NO含量)×100%

1.2.3.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進行正態(tài)性分布檢驗和方差齊性檢驗，采用獨立樣本t檢驗對各組NO 抑制率進行比較，以P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 醋柴胡多糖VBCP-3的提取與純化

醋柴胡采用700 mL/L乙醇脫脂，經(jīng)過熱水提取，水提醇沉，Sevage法脫蛋白后，得到醋柴胡總多糖。通過DEAE-FF陰離子交換柱以不同濃度洗脫劑洗脫(圖1)，獲得不同的組分，其中0.2 mol/L NaCl溶液洗脫得到醋柴胡精多糖，命名為VBCP-3。

圖1VBCP-3的DEAE-FF陰離子交換層析洗脫曲線圖

2.2 醋柴胡多糖VBCP-3的結(jié)構(gòu)

通過紫外分光度計全波長掃描可知， VBCP-3在260 nm和280 nm處無明顯吸收峰，提示醋柴胡多糖VBCP-3不含核酸和蛋白質(zhì)。以葡聚糖D18K、D40K、D60K、D215K、D855K為標(biāo)準(zhǔn)品繪制多糖分子量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為：t=-4.781 1×lg(Mw)+39.42(R2=0.9965)。醋柴胡多糖VBCP-3峰寬較窄，分布均一，其分子質(zhì)量為436.221 ku(圖2)。

VBCP-3的紅外圖譜(圖3)顯示其具有多糖的一般結(jié)構(gòu)特征，在3 300.11 cm-1處有寬而鈍的吸收，是O-H的伸縮振動峰，2942.8 cm-1處是C-H伸縮振動峰，1 594.30 cm-1處是-CHO的C=O的伸縮振動峰，在1 100 cm-1～1 010 cm-1附近有3個吸收峰，提示VBCP-3為吡喃糖。通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖比對，并通過峰面積計算可知，VBCP-3的單糖組成及摩爾比為鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖=1.3∶24.9∶3.2∶1.00(圖4、圖5)。

2.3 醋柴胡多糖VBCP-3的抗炎活性

醋柴胡多糖VBCP-3對RAW264.7細胞增殖的影響見圖6，VBCP-3在3.9 mg/L～125 mg/L范圍內(nèi)存活率均在80%以上，說明在該范圍內(nèi)VBCP-3對RAW264.7細胞無明顯毒性，故可在3.9 mg/L～125 mg/L范圍內(nèi)選取合適濃度進行下一步試驗。

圖2VBCP-3分子量色譜圖

圖3VBCP-3的紅外光譜圖

以LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細胞，產(chǎn)生炎癥因子，根據(jù)Griess法測定NO的釋放量，考察待測藥物對細胞炎癥的影響。NO在0～100 μmol/L范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.003 9x+0.040 6(R2=0.999 8)。與正常組相比，經(jīng)LPS刺激后，細胞產(chǎn)生大量的NO(P<0.01)；陽性藥物地塞米松顯著抑制NO釋放(P<0.01)，其抑制率為70.07%，說明炎癥模型造模成功。與模型組相比，含量7.8 mg/L～125 mg/L的醋柴胡多糖VBCP-3能顯著抑制炎癥因子NO的釋放，其中7.8、31.25、125 mg/L的VBCP-3的NO抑制率分別為44.18%、74.34%和86.53%(P<0.01)，抑制效果隨VBCP-3濃度增大而增強。與陽性藥物地塞米松相比，125 mg/L的VBCP-3多糖具有顯著的抗炎作用(P<0.01)(圖7)。

3 討論

柴胡多糖具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，文獻報道柴胡醋炙后抗炎作用減弱，疏肝解郁、減肥、降血脂等作用增強，而且能增加與其配伍藥物在肝臟的分布[10-11]，而醋制后柴胡多糖是否具有抗炎活性，目前少有報道。 本文從醋柴胡中提取、分離得到多糖VBCP-3，并對其結(jié)構(gòu)及活性的進行初步探討。結(jié)果顯示得到的VBCP-3為吡喃糖，分子質(zhì)量為436.221 ku，單糖組成及摩爾比為鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖=1.3∶24.9∶3.2∶1.00，屬于中性雜多糖。VBCP-3的單糖組成和分子質(zhì)量與文獻已知的柴胡多糖均不同[12-13]，為新發(fā)現(xiàn)的多糖。

圖4單糖組成混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.葡萄糖；4.半乳糖1.Rhamnose; 2.Arabinose; 3.Glucose; 4.Galactose

圖6不同濃度VBCP-3的細胞存活率(n=3)

與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01；與陽性藥物組比較，++P<0.01；+表示含有該物質(zhì)，-表示不含該物質(zhì)

一氧化氮(NO)在心血管、消化、免疫、呼吸等系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中具有廣泛的病理生理作用，被普遍認為是細胞內(nèi)傳導(dǎo)信號的第二信使。正常狀態(tài)下，細胞NO含量很少。LPS為細菌等物質(zhì)含有的多糖，是常見的致炎因子，當(dāng)細胞被LPS等物質(zhì)刺激時，大量的 NO 被誘導(dǎo)表達進而介導(dǎo)炎癥等疾病的發(fā)生與發(fā)展，NO含量可以作為炎癥反應(yīng)程度的指標(biāo)[14]。小鼠巨噬細胞在受LPS刺激后可以產(chǎn)生NO，柴胡多糖能顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞分泌NO的水平(P<0.01)，80 mg/L柴胡多糖溶液的NO抑制率為22.22%[15]。而本研究顯示7.8 mg/L～125 mg/L濃度范圍的醋柴胡多糖VBCP-3能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞分泌NO(P<0.01)，其中31.25 mg/L濃度VBCP-3的NO抑制率為74.34%，高于文獻。提示VBCP-3對NO的抑制作用大于柴胡多糖，柴胡醋制后多糖仍具抗炎活性。本研究提取分離出分子質(zhì)量為436.221 ku、均一的醋柴胡精多糖VBCP-3，能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量，表明醋柴胡多糖也具有抗炎活性，有良好的應(yīng)用潛力，但其抗炎作用的機制有待進一步探討與論證。