郭 濤，李村院,2，劉開平，李曉悅，胡瑞瑞，李雅心，王小奎，倪 偉*，胡圣偉*

(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性、高度傳染性和致死性疾病[1]。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為仔豬嘔吐、腹瀉、脫水以及體重減輕；病理組織學(xué)變化主要表現(xiàn)為空腸和回腸腸絨毛萎縮等。PED在冬季和春季極易發(fā)生，夏季相對(duì)較少，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致仔豬死亡，以新生2周齡以下仔豬病死率最高(甚至可達(dá)到100%)[2]。2010年冬季，我國(guó)廣東、廣西、四川等南方地區(qū)先后暴發(fā)大規(guī)模PED疫情[3]，目前PEDV已經(jīng)侵襲全球多個(gè)國(guó)家與地區(qū)，尤以歐洲和亞洲最為嚴(yán)重，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

PEDV隸屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，基因組為單股正鏈RNA，全基因組長(zhǎng)約28 kb[6]，其結(jié)構(gòu)蛋白主要有糖基化纖突蛋白(S蛋白)、糖基化囊膜蛋白(M蛋白)、RNA結(jié)合的未糖基化核衣殼蛋白(N蛋白)、小膜蛋白(E蛋白)。S蛋白位于病毒粒子表面，介導(dǎo)病毒的吸附、融合和侵入宿主細(xì)胞等基本生物學(xué)功能，通常被認(rèn)為由S1(1-789 aa)和S2(790-1 383 aa)組成。S1蛋白COE區(qū)域(499-638 aa)是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，同時(shí)，S1蛋白S1D(636-789 aa)區(qū)包含1個(gè)線性抗原表位(697-742 aa)和2個(gè)B細(xì)胞表位(744-759 aa和756-771 aa)[7]。因此，S蛋白是研發(fā)抗PED藥物的重要靶標(biāo)蛋白。

腸道黏膜免疫所產(chǎn)生的分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗體[8-9]，能夠在腸道中發(fā)揮黏膜免疫作用和清除PEDV的作用，對(duì)PED防控具有重要意義。納米抗體是自然界存在的可與抗原結(jié)合的最小片段，具有免疫原性低、穩(wěn)定性強(qiáng)、親和力高、組織穿透性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已在基礎(chǔ)研究、新藥開發(fā)和疾病診治上有廣泛研究和應(yīng)用[10]。納米抗體因其分子質(zhì)量小的特性，便于將兩個(gè)或多個(gè)納米抗體串聯(lián)，達(dá)到識(shí)別一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面受體結(jié)合位點(diǎn)效果，可以比針對(duì)單一抗原表位的抗體發(fā)揮更好的免疫作用。 有研究已成功分離出抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)的納米抗體，并構(gòu)建成串聯(lián)雙價(jià)單特異性抗體，在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中展現(xiàn)出了積極的作用[11]?；赑EDV腸道感染的特點(diǎn)和納米抗體分子質(zhì)量小的優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)室將兩段靶向PEDV的納米抗體序列串聯(lián)，并與豬IgA可結(jié)晶段(fragment crystallizable，F(xiàn)c)融合，成功構(gòu)建了pUC57-NB3-NB6-Fc質(zhì)粒。本試驗(yàn)探究了NB3-NB6-Fc蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，為后期制備PEDV抗體藥物和口服飼料提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒E.coliDH5α、畢赤酵母GS115、真核表達(dá)載體pPIC9K及pUC57-NB3-NB6-Fc質(zhì)粒均為動(dòng)物基因工程實(shí)驗(yàn)室保存。目的基因NB3-NB6-Fc序列全長(zhǎng)1 488 bp，基因5′末端酶切位點(diǎn)為SnabⅠ，3′末端酶切位點(diǎn)為NotⅠ。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SnabⅠ和NotⅠ、Premixed protein marker均為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；G418為Sigma公司產(chǎn)品；酵母提取物、胰蛋白胨均為OXOID公司產(chǎn)品；生物素、酵母氮源培養(yǎng)基等常用試劑及TCA濃縮試劑盒、小鼠抗6X His單克隆抗體、羊抗鼠IgG-HRP均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，引物合成及測(cè)序均由其完成。

1.1.3 儀器設(shè)備 Mastercycler pro梯度PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；KS 4000 iC控溫?fù)u床，IKA公司產(chǎn)品；蛋白電泳儀、瓊脂糖凝膠核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；半干轉(zhuǎn)膜儀，伯樂公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 NB3-NB6-Fc蛋白生物信息學(xué)分析 NB3-NB6-Fc蛋白理化性質(zhì)由生物信息學(xué)工具ExPASyprotparam在線分析完成；二級(jí)結(jié)構(gòu)由SOPMA進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；三維空間構(gòu)象由Swiss-model進(jìn)行模擬預(yù)測(cè)。

1.2.2 畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 提取pUC57-NB3-NB6-Fc質(zhì)粒和酵母表達(dá)載體pPIC9K質(zhì)粒，利用SnabⅠ/NotⅠ在37℃條件下酶切2 h，酶切后進(jìn)行酶切產(chǎn)物回收和純化，利用T4 DNA連接酶在16℃、4 h的條件下進(jìn)行連接，重組為pPIC9K-NB3-NB6-Fc。

1.2.3 畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備 取保存于-80℃冰箱的畢赤酵母GS115甘油菌，劃線接種于YPD平板上，30℃培養(yǎng)2 d，挑單菌落于1 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min～250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)接于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD值1.2～1.5，4℃、5 000 r/min離心5 min收集沉淀菌體，用100 mL預(yù)冷無菌水洗滌2次，20 mL預(yù)冷1 mol/L山梨醇洗滌1次，重懸于200 μL預(yù)冷1 mol/L山梨醇中，制得感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.4 重組表達(dá)載體的酵母電轉(zhuǎn)化 將1.2.3構(gòu)建得到的重組表達(dá)質(zhì)粒用SacⅠ酶切使之線性化后，冰上預(yù)冷15 min，取3 μg～5 μg，與80 μL酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞混勻，迅速轉(zhuǎn)移入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯，1 500 V電壓刺激5 ms后立即加入800 μL預(yù)冷1 mol/L山梨醇溶液混勻，涂布于MD培養(yǎng)基，30℃生長(zhǎng)3 d～4 d。待長(zhǎng)出陽性單克隆后轉(zhuǎn)涂0.5、1.0、1.5 mg/mL的G418抗生素的YPD固體平板上，培養(yǎng)2 d～3 d，篩選多拷貝重組子。用相同的方法轉(zhuǎn)化空載體作為陰性對(duì)照。

1.2.5 重組酵母菌落基因組PCR鑒定 挑取若干個(gè)單菌落于2.5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min～220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，各取500 μL提取酵母基因組，用pPIC9K的通用引物AOX-1進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其中以線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒作為陽性對(duì)照。引物序列為：上游引物：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；下游引物：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min,95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，陽性重組質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá) 活化：挑選若干個(gè)經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證為陽性的單克隆菌株，于5 mL YPD液體培養(yǎng)基30℃、220 r/min培養(yǎng)過夜；擴(kuò)大：分別接種50 μL菌液于15 mL BMGY培養(yǎng)基，30℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液OD600nm為2～3；誘導(dǎo)：5 000 r/min離心5 min，棄上清，收集沉淀重懸于15 mL BMMY培養(yǎng)基，29℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每12 h加入甲醇至終濃度為8 mL/L；檢測(cè)：取發(fā)酵結(jié)束后的菌液1 mL，5 000 r/min離心5 min，取上清，根據(jù)TCA濃縮試劑盒方法處理樣品，以誘導(dǎo)后的空載體作為陰性對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.7 重組蛋白Western blot鑒定 Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證目的蛋白是否成功表達(dá)。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉過夜，用小鼠抗6×His抗體作為一抗，37℃孵育2 h，TBST洗滌后再用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體作為二抗，37℃孵育1 h，TBST洗滌后用DAB顯色進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 NB3-NB6-Fc蛋白生物信息學(xué)分析

NB3-NB6-Fc蛋白含有496個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為53.2 ku，等電點(diǎn)為7.58，用ExPASyprotparam計(jì)算得到平均疏水性為-0.232，預(yù)測(cè)該抗體蛋白是親水性蛋白。通過Swiss-model在線預(yù)測(cè)NB3-NB6-Fc蛋白的空間結(jié)構(gòu)相對(duì)緊密，具有豐富的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，β-折疊結(jié)構(gòu)較少(圖1)。

圖1NB3-NB6-Fc蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2 pPIC9K-NB3-NB6-Fc表達(dá)載體構(gòu)建

克隆載體pUC57-NB3-NB6-Fc及pPIC9K質(zhì)粒經(jīng)SnabⅠ/NotⅠ雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物并連接，將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，在1 488 bp處可見與預(yù)期相符的目的基因條帶。質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序后，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相吻合，表明pPIC9K-NB3-NB6-Fc載體構(gòu)建成功(圖2)。

2.3 pPIC9K-NB3-NB6-Fc重組酵母菌株篩選與鑒定

pPIC9K-NB3-NB6-Fc質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ酶過夜酶切，可看到約10 764 bp大小的條帶，與預(yù)期9 276 bp+1 488 bp相符合(圖3A)，表明線性化成功。將線性化的pPIC9K-NB3-NB6-Fc和空載體pPIC9K分別電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115后，分別涂布于MD平板上。經(jīng)不同濃度G418抗生素的YPD固體平板篩選后，挑取7個(gè)生長(zhǎng)良好的陽性轉(zhuǎn)化子。以重組酵母菌基因組為模板，用AOX-1檢測(cè)引物進(jìn)行PCR鑒定。與線性化陽性對(duì)照質(zhì)粒相比，在2 000 bp左右處出現(xiàn)與陽性對(duì)照相近的條帶，說明重組表達(dá)載體的5’AOX1區(qū)域與酵母宿主菌的同源序列發(fā)生整合，pPIC9K-NB3-NB6-Fc正確插入酵母菌染色體，將重組酵母命名為pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115，空載體重組酵母菌命名為pPIC9K-GS115(圖3B)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.SnabⅠ/NotⅠ酶切鑒定M.DNA Maker DL 2 000；1.Digestion with SnabⅠ and NotⅠ

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；A1.pPIC9K-NB3-NB6-Fc質(zhì)粒；A2.線性化質(zhì)粒；B1～B10.pPIC9K-NB3-NB6-Fc質(zhì)粒；B11.線性化質(zhì)粒

2.4 NB3-NB6-Fc蛋白表達(dá)與鑒定

對(duì)PCR鑒定后的1、3、4、6、7、9、10號(hào)pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115首先接種在BMGY培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 h～20 h后，離心收集菌體，重懸于等量BMMY培養(yǎng)基，29℃甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物上清液經(jīng)TCA濃縮處理后，利用SDS-PAGE進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照相比，1、2、3、6泳道中在相應(yīng)大小附近處出現(xiàn)與預(yù)測(cè)蛋白大小(53.2 ku)相吻合的特異性條帶(圖4)。

為了進(jìn)一步確認(rèn)誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白，使用His標(biāo)簽抗體利用Western blot技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。檢測(cè)結(jié)果顯示，2、3、4、7泳道在53.2 ku大小附近檢測(cè)到明顯特異性表達(dá)條帶，再次證實(shí)NB3-NB6-Fc蛋白成功分泌表達(dá)(圖5)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7.pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115誘導(dǎo)上清；8.pPIC9K-GS115空質(zhì)粒誘導(dǎo)上清

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陽性對(duì)照；2～8.pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115誘導(dǎo)上清；9.pPIC9K-GS115空質(zhì)粒誘導(dǎo)上清

3 討論

近年來對(duì)PED的暴發(fā)仍然缺乏有效的防控方案，亞洲地區(qū)PED疫情較為嚴(yán)重，除病毒發(fā)生變異外，還與豬群免疫力低下有關(guān)。PEDV極易感染新生仔豬，2周齡內(nèi)仔豬感染率可高達(dá)90%[12]，且新生仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，母源抗體保護(hù)效果有限，依靠疫苗的主動(dòng)免疫無法提供及時(shí)的保護(hù)作用[13]，因此開發(fā)新型抗PEDV藥物對(duì)PED的防控有重大意義。

存在于外分泌液(如乳汁、胃腸液等)的SIgA是機(jī)體黏膜免疫最重要的抗體，能夠抵御呼吸道、消化道、泌尿生殖道中病原體的侵害。由于PEDV具有腸道組織嗜性，主要通過腸道感染機(jī)體，因此本試驗(yàn)將PEDV納米抗體NB3-NB6與IgA Fc段(即鉸鏈區(qū)和CH2-CH3區(qū))相連接，既可通過納米抗體介導(dǎo)免疫細(xì)胞吞噬、清除病毒，其Fc段也可識(shí)別IgA Fc受體(FcαRI，CD89)[14]，發(fā)揮其相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)，引起抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)以及抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)等[15]。有研究篩選出了針對(duì)腸毒性大腸埃希氏菌(ETEC)的納米抗體，與豬sIgA的Fc段拼接融，并與分泌成分(SC)、J鏈共表達(dá)，成功在擬南芥種子中表達(dá)了重組的單體VHH-IgA(mVHH-IgA)、二聚體VHH-IgA(dVHH-IgA)以及分泌型VHH-IgA(sVHH-IgA)，將種子摻入飼料中可以產(chǎn)生針對(duì)ETEC有效的保護(hù)[16]。將2個(gè)抗口蹄疫病毒(FMDV)納米抗體連接到豬IgG上，得到的雙特異性納米抗體，用藥后可以明顯減少和延緩口蹄疫發(fā)生，甚至可以抑制FMDV的傳播[17]。可見，將納米抗體與免疫球蛋白Fc片段融合的方法已經(jīng)發(fā)展為制備基因工程抗體藥物的重要手段。

巴斯德畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，具有操作方便、生長(zhǎng)快速和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，最主要的區(qū)別是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可進(jìn)行外源基因翻譯后的加工與修飾，完成蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵的形成和糖基化等復(fù)雜的處理過程，還能夠?qū)⒖扇苄?、正確折疊的蛋白產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已發(fā)展成為研究真核蛋白的一種重要手段，廣泛應(yīng)用于蛋白酶、激素、抗體等生物活性蛋白的研究和生產(chǎn)[18-19]。

本試驗(yàn)首先利用生物信息學(xué)工具，預(yù)測(cè)NB3-NB6-Fc蛋白可折疊形成含有多個(gè)溝槽的高級(jí)結(jié)構(gòu)，有利于與抗原結(jié)合，之后將NB3-NB6-Fc基因連接至pPIC9K酵母分泌型表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-NB3-NB6-Fc并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子后，進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析表明NB3-NB6-Fc融合抗體成功分泌表達(dá)。本試驗(yàn)證實(shí)NB3-NB6-Fc抗體蛋白能夠由畢赤酵母GS115成功分泌表達(dá)至培養(yǎng)基中，可減少雜蛋白的影響，也為下游分離純化和鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。后期可探索適宜的搖瓶發(fā)酵條件，純化抗體蛋白并進(jìn)行功能驗(yàn)證，為未來在抗體藥物和口服飼料方向?yàn)镻ED的防控提供材料。