郭承意，仝麗娜，周 雷，李增魁，文 英，劉海金，楊增岐*，高小龍*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種烈性傳染病，能夠在雞和多種禽類中廣泛傳播，是威脅養(yǎng)禽業(yè)的最主要疫病之一[1]。雞感染后主要臨床特征為呼吸困難、腹瀉、神經(jīng)紊亂以及黏膜和皮膚出血。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將新城疫列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。NDV為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亞科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒屬(Aoulavirus)[2]。NDV基因組由15186、15192或15198個(gè)核苷酸組成，全基因組上依次排列著NP、P、M、F、HN和L基因，分別編碼核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)酪氨酸(HN)和大分子蛋白(L)[3]。

反向遺傳技術(shù)是研究生物基因與性狀關(guān)系，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)在DNA水平對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行一系列操作(如突變、缺失、插入、替換等)，進(jìn)而探究基因改變對(duì)生物性狀的影響。人們已經(jīng)構(gòu)建了許多重組病毒，通過(guò)對(duì)比重組病毒和親本毒株的差異，闡明了影響病毒毒力、復(fù)制能力、抗原位點(diǎn)變異、組織嗜性等許多科學(xué)問(wèn)題[4-6]。NDV重組病毒的研究為后續(xù)NDV感染性克隆試驗(yàn)奠定了一定的基礎(chǔ)[7]。近年已有多種NDV感染性克隆構(gòu)建系統(tǒng)，根據(jù)全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)錄時(shí)所用啟動(dòng)子不同，可將NDV感染性克隆分為兩種，一種是基于T7啟動(dòng)子系統(tǒng)，另一種是巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動(dòng)子系統(tǒng)[8]。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA克隆的方法不同，又可分為傳統(tǒng)酶切連接克隆法、不依賴酶切的克隆法(LIC)和合成克隆法。傳統(tǒng)的酶切連接克隆法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且受酶切位點(diǎn)限制；而LIC主要依靠融合技術(shù)，相對(duì)酶切連接法效率高。為提高載體通用性及提高全長(zhǎng)cDNA克隆效率，本研究擬構(gòu)建一種NDV全長(zhǎng)cDNA克隆雙啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄載體，為簡(jiǎn)便快速構(gòu)建NDV感染性克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 T4 DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；SalⅠ、EcoR Ⅴ、BglⅡ、NotⅠ、SacⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Fisher公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Trans 2K Plus DNA Marker，TransStart?Fast Pfu DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 質(zhì)粒 pCI-neo、pEGFP-N1、pAd-track CMV均為西北農(nóng)林科技大學(xué)楊增岐教授饋贈(zèng)，由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 梯度PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；核酸電泳設(shè)備、凝膠圖像成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 linker序列的設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[9-11]，設(shè)計(jì)合成linker基因序列，該序列所含元件分別為“T7P-GGG-HamR-NDV 5′UTR-KpnⅠ-SmaⅠ-NDV 3′UTR-HdvR-T7 termi-SV3-NotⅠ”；設(shè)計(jì)好的序列由江蘇金唯智公司合成，合成的linker序列裝載于pUC57載體上。序列詳細(xì)信息如下：

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參考pCI-neo、pEGFP-N1、pAd-track CMV載體的序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼GFP和Kan基因的引物，引物由江蘇金唯智公司合成(表1)。

1.2.3GFP和Kan基因片段的獲得 以pEGFP-N1質(zhì)粒作為模板，GFP-F和GFP-R為引物，在Pfu DNA聚合酶作用下通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得GFP基因片段。PCR擴(kuò)增體系如下：5×trans Pfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 5 μL，Pfu DNA聚合酶1 μL，上、下游引物各1.5 μL，pEGFP-N1質(zhì)粒0.2 μL，用無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，預(yù)期條帶大小1 000 bp，膠回收1 000 bp左右的目的條帶，即為GFP基因片段。

以pAd-track CMV質(zhì)粒為模板。以Kan-F和Kan-R為引物，在Pfu DNA聚合酶作用下通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得Kan基因片段，加樣體系如下：5×trans Pfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP5 μL，Pfu DNA聚合酶1 μL，上、下游引物各1.5 μL，pAd-track CMV質(zhì)粒 0.2 μL，用無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 40 s，62℃ 40 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，預(yù)期條帶大小2 800 bp，膠回收2 800 bp左右的目的條帶，即為Kan基因片段。

表1引物信息

1.2.4GFP和Kan基因片段的融合 以1.2.3中回收的GFP和Kan基因片段為模板，通過(guò)Overlap PCR擴(kuò)增獲得GFP-Kan融合基因片段，PCR加樣體系如下：5×trans Pfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 5 μL，Pfu DNA聚合酶1 μL，引物GPF-F 1.5 μL，引物Kan-R 1.5 μL，回收的GFP基因片段1 μL，回收的Kan基因片段5 μL，用無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 40 s，55℃40 s，72℃ 1.5 min ，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，預(yù)期條帶大小3 800 bp，膠回收目的條帶，即為GFP-Kan融合基因片段。

1.2.5 pCI-GFP/Kan載體構(gòu)建BglⅡ和SalⅠ雙酶切pCI-neo載體和膠回收的GFP-Kan融合基因片段。酶切體系分別如下：①BglⅡ 0.5 μL，SalⅠ 0.5 μL，pCI-neo質(zhì)粒4 μL，10×bufferO 2 μL，無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足20 μL；②BglⅡ 0.5 μL，SalⅠ 0.5 μL，GFP-Kan融合片段9 μL，10×bufferO 2 μL，無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足20 μL。37℃，酶切2 h。酶切產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收①中1 000 bp和②中3 800 bp左右的目的條帶。

用T4 DNA連接酶連接pCI-neo酶切后1 000 bp條帶與GFP-Kan酶切后3 800 bp的條帶。連接體系如下：10×T4 ligasebuffer 1 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，pCI-neo酶切產(chǎn)物3 μL，GFP-Kan基因酶切產(chǎn)物1.5 μL，無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足10 μL。16℃連接過(guò)夜。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布卡那抗性LB平板，挑選平板上的陽(yáng)性克隆做酶切鑒定。

1.2.6 pCI-GFP/Kan載體鑒定 酶切鑒定正確的載體送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組載體命名為pCI-GFP/Kan。為進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建的pCI-GFP/Kan載體上CMV啟動(dòng)子能否正常工作，取2 μg pCI-GFP/Kan轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，參照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染36 h后，于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光，并設(shè)立pEGFP-N1為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染空細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.2.7 pCI-infect載體構(gòu)建 用SacⅠ和NotⅠ雙酶切pUC57-Linker和pCI-GFP/Kan，體系為①SacⅠ 0.6 μL，NotⅠ 0.6 μL，10×tango buffer 4 μL，pUC57-Linker 5 μL，無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足20 μL；②SacⅠ 0.6 μL，NotⅠ 0.6 μL，10×tango buffer 4 μL，pCI-GFP/Kan 4 μL，無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足20 μL。37℃酶切2 h，酶切產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收①中3 800 bp和②中800 bp的目的條帶進(jìn)行連接，連接體系如下：10×T4 ligase buffer 1 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，pCI-GFP/Kan酶切回收產(chǎn)物1 μL，pUC57-Linker酶切回收產(chǎn)物2.5 μL，無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足10 μL。16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布卡那抗性LB平板，挑選平板上的陽(yáng)性克隆做酶切和測(cè)序鑒定，鑒定正確的重組載體命名為pCI-infect。

2 結(jié)果

2.1 GFP和Kan基因片段的擴(kuò)增結(jié)果

以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板，用GFP-F和GFP-R為引物，在Pfu DNA聚合酶作用下通過(guò)PCR獲得1 000 bp左右的GFP條帶(圖1)。膠回收1 000 bp的目的條帶，即為GFP基因片段。以pAd-track CMV質(zhì)粒為模板，用Kan-F和Kan-R為引物，在Pfu DNA聚合酶作用下擴(kuò)增出2 800 bp左右的目的條帶(圖2)。膠回收此2 800 bp的目的條帶，即為Kan基因片段。

2.2 GFP-Kan基因片段的融合擴(kuò)增

以上步回收的GFP和Kan基因片段為模板，以GFP-F和Kan-R為引物，通過(guò)Overlap PCR擴(kuò)增獲得3 800 bp的GFP-Kan融合基因片段，同時(shí)在1 000 bp～2 000 bp和大于5 000 bp處有2條非特異性條帶(圖3)。膠回收3 800 bp目的條帶，即為GFP-Kan融合基因片段。

2.3 pCI-EGFP/Kan載體構(gòu)建與鑒定

用BglⅡ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切pCI-neo質(zhì)粒和GFP-Kan融合片段，切出1 000 bp和3 800 bp的目的條帶(圖4)。膠回收1 000 bp左右的pCI-neo酶切條帶以及3 800 bp左右的GFP-Kan酶切條帶，進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布卡那抗性LB平板，挑取平板上長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆，搖菌后抽提質(zhì)粒。抽提的4個(gè)克隆的質(zhì)粒用EcoRⅤ進(jìn)行單酶切和測(cè)序鑒定，顯示序列均正確，重組載體命名為pCI-GFP/Kan。為確定構(gòu)建的pCI-GFP/Kan載體中CMV啟動(dòng)子可否正常工作，用2 μg pCI-GFP/Kan轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后36 h于倒置顯熒光微鏡下觀察(圖5)，結(jié)果表明CMV啟動(dòng)子可以正常工作。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～2.GFP基因片段M.DNA Marker DL 5 000; 1-2.GFP amplified products

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～2.Kan基因片段M.DNA Marker DL 5 000; 1-2.Kan amplified products

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～2.GFP/Kan基因片段M.DNA Marker DL 5 000; 1-2.GFP/Kan amplified products

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～2.pCI-neo載體雙酶切；3～4.GFP/Kan基因片段雙酶切

A.pCI-GFP/Kan; B.pEGFP-N1; C.Negative control

2.4 pCI-infect載體構(gòu)建

用SacⅠ和NotⅠ雙酶切pCI-GFP/Kan和pUC57-linker載體(圖6)，切出3 800 bp和800 bp的目的條帶。膠回收3 800 bp和800 bp的目的條帶。將回收的條帶用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素抗性平板，培養(yǎng)后挑取平板上的克隆，搖菌提取質(zhì)粒后用SacⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，切出800 bp和3800 bp目的條帶(圖7)。進(jìn)行測(cè)序后，顯示序列均正確，表明pCI-infect構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～2.pCI-GFP/Kan雙酶切；3～4.pUC57-linker雙酶切

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.pCI-infect雙酶切M.DNA Marker DL 5 000; 1.Double enzyme digestion of pCI-infect

3 討論

本研究為提高載體通用性，采用了雙啟動(dòng)子系統(tǒng)，在反義基因組5′端同時(shí)設(shè)計(jì)了CMV和T7啟動(dòng)子，在CMV和T7啟動(dòng)子之間添加了intron，避免相互干擾。同時(shí)為了提高T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率，在T7啟動(dòng)子后添加了3個(gè)G[11]。轉(zhuǎn)錄后的病毒基因組RNA序列5′和3′末端的精確性對(duì)病毒拯救至關(guān)重要[12]，為使病毒cDNA轉(zhuǎn)錄時(shí)能產(chǎn)生無(wú)任何冗余序列的精確5′末端和3′末端，提高拯救效率，在linker設(shè)計(jì)時(shí)在NDV 5′UTR和3′UTR區(qū)分別添加了58 bp的錘頭狀核酶(HamR)序列和89 bp的丙型肝炎病毒核酶(HdvR)序列元件，保證轉(zhuǎn)錄出精確的病毒RNA末端序列。

由于真核細(xì)胞RNA聚合酶一般位于細(xì)胞核中，在構(gòu)建伯爾納病毒感染性克隆微基因組時(shí)，在微基因組末端添加了衍生于猴病毒40(SV40)的SV3入核信號(hào)序列，顯著提高了微基因組拯救效率。利用Ⅱ型RNA聚合酶構(gòu)建感染性克隆時(shí)，相比于SV40早期多聚腺苷酸化信號(hào)，在HdvR后添加SV40晚期多聚腺苷酸化信號(hào)可顯著提高cDNA轉(zhuǎn)錄效率[13]。本研究為保證后期cDNA獲得較高的轉(zhuǎn)錄效率，在反義基因組3′末端HdvR序列后添加了SV3元件和SV40晚期多聚腺苷酸化信號(hào)。

載體的大小和抗性對(duì)全長(zhǎng)cDNA克隆構(gòu)建也有影響，本研究中載體大小由最初的5.4 kb(pCI-neo)變?yōu)?.6 kb(pCI-infect)，易于后期NDV全基因克??；為與常用的Amp抗性載體加以區(qū)分，避免污染和易于篩選，在構(gòu)建中將pCI-neo載體上的Amp抗性替換為Kan抗性。但在融合Kan基因片段和GFP基因片段時(shí)，除擴(kuò)增出3 800 bp大小的預(yù)期條帶外，還出現(xiàn)兩條非特異性條帶(圖3)，一條非特異性條帶大于5 000 bp，另一條非特異性條帶大小為1 000 bp～2 000 bp，經(jīng)優(yōu)化退火溫度和PCR反應(yīng)體系，上述兩條非特異性條帶仍存在，但非特異性條帶與3 800 bp的目的條帶通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可加以區(qū)分，且經(jīng)切膠、回收克隆和測(cè)序后，顯示GFP-Kan基因片段正確。本研究構(gòu)建了一種NDV全長(zhǎng)cDNA克隆雙啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄載體，為簡(jiǎn)便快速構(gòu)建NDV感染性克隆積累了材料。