劉麗萍，火興民，謝 飛，張旺東，吳秀萍，李 瑞，陸 佳，王雯慧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

新生動(dòng)物Fc受體(FcRn)是一種跨膜型的異質(zhì)二聚體糖蛋白，由一條重鏈(α鏈)與一條可溶性的輕鏈(β鏈)β2-微球蛋白(β2m)以非共價(jià)鍵連接組成[1]。FcRn重鏈由FCGRT基因編碼，由3個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域 (a1、a2和a3)、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)由44個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞質(zhì)尾部構(gòu)成[2]。雖然FcRn與組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ在結(jié)構(gòu)上高度相似，但由于其狹窄的抗原結(jié)合凹槽而不能與抗原肽結(jié)合[1,3]。FcRn結(jié)合配體IgG和白蛋白具有pH依賴性，即在低pH(pH ≤6.5)時(shí)能與它們的Fc區(qū)域結(jié)合，而在生理pH(7.3～7.4)下將其釋放[4]，從而保護(hù)IgG和白蛋白免受細(xì)胞內(nèi)溶酶體的降解，延長它們在血液循環(huán)中的半衰期[5-6]。在缺乏FcRn的小鼠中，IgG和白蛋白的半衰期均縮短至約1 d，意味著IgG的半衰期縮短了4倍～5倍，并且白蛋白的半衰期縮短了1.5倍～2倍[3]。在動(dòng)物模型中FcRn的缺乏會(huì)導(dǎo)致血漿中IgG濃度和對(duì)自身免疫性疾病的抵抗力均降低[7]。FcRn首次被發(fā)現(xiàn)在嚙齒類動(dòng)物中作為轉(zhuǎn)運(yùn)母體IgGs跨越新生兒腸黏膜的受體，其表達(dá)具有物種、年齡及組織細(xì)胞差異性。如FcRn在人類胎兒和成人腸上皮細(xì)胞中均可高度表達(dá)[8]，但在嚙齒類動(dòng)物中，F(xiàn)cRn僅在新生兒的小腸近端腸上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，斷奶后其表達(dá)水平急劇下降[2]，而在成年鼠中表達(dá)量不高[9]。FcRn在所有物種的肺泡巨噬細(xì)胞中均可高度表達(dá)，但在造血細(xì)胞系中，F(xiàn)cRn的表達(dá)僅限于髓細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[1]。作為一種抗體轉(zhuǎn)運(yùn)體，F(xiàn)cRn通過攜帶母體IgG穿過胎盤合胞體滋養(yǎng)層、呼吸道、腸道和生殖道的極化上皮細(xì)胞從而建立被動(dòng)免疫[10]。FcRn也是提供藥物、治療和疫苗的一個(gè)目標(biāo)[11]?？傊?，F(xiàn)cRn在建立早期新生兒免疫中起關(guān)鍵作用，并參與自然感染和疫苗接種的免疫反應(yīng)。

本課題組已成功制備出雙峰駝IgA、 IgM、IgE多克隆抗體，并研究了其在雙峰駝腭扁桃體的分布特征[12-13]；從血清中分離出雙峰駝IgG抗體并研究其在小腸中的分布特征[14]。本試驗(yàn)首先合成雙峰駝FCGRT基因序列并構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后原核表達(dá)及優(yōu)化表達(dá)條件，最后用純化后的重組蛋白免疫家兔，制備兔抗雙峰駝FcRn多克隆抗體，并通過間接ELISA和Western blot檢測效價(jià)及特異性，為雙峰駝黏膜免疫的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔，雄性，體重約2.3 kg，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 載體pET-28a(+)、感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，Solarbio生物科技有限公司產(chǎn)品； His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG， BOSTER生物工程有限公司產(chǎn)品；雙峰駝FcRn重組蛋白，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.3 主要儀器 紫外分光光度儀，美國GE公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞破碎儀，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；全波長酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雙峰駝FCGRT基因的合成與重組質(zhì)粒的構(gòu)建 首先參照NCBI收錄的雙峰駝FcRn基因序列(GenBank accession no.XM-010946978.1)，選取編碼區(qū)(CDs)，經(jīng)DNA STAR和TMHMM Server 2.0軟件進(jìn)行FcRn蛋白抗原表位和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，截取膜外部分；然后利用SignalP 4.1 Server軟件進(jìn)行FcRn蛋白信號(hào)肽預(yù)測，截除信號(hào)肽部分后，在堿基序列的上游和下游分別添加起始密碼子ATG和終止密碼子TAG；接著，用Primer 5進(jìn)行酶切位點(diǎn)預(yù)測，添加酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ；最終，將截取的FcRn進(jìn)行堿基優(yōu)化后送金唯智生物科技有限公司合成，并與pET-28a(+)載體連接后轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒經(jīng)測序分析，將測序正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pET-28a-FcRn。

1.2.2 pET-28a-FcRn重組質(zhì)粒在大腸埃希氏菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式 將公司構(gòu)建的pET-28a-FcRn重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(ED3)中，挑取單個(gè)菌落于滅菌的LB液體培養(yǎng)基中(Kan+)，37℃培養(yǎng)至OD 600 nm值達(dá)到0.60.8時(shí)，用1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h后收集菌體，置于-80℃反復(fù)凍融3次，超聲破碎至液體清亮為止(約40 min)，分別收集上清和沉淀。最終，將所有的樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 雙峰駝FcRn重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化與純化 為了提高FcRn重組蛋白的表達(dá)量，分別采用不同IPTG 濃度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mmol/L)和不同誘導(dǎo)時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，然后進(jìn)行SDS-PAGE檢測。在最優(yōu)條件下，大批量表達(dá)FcRn重組蛋白，超聲破碎菌體，依據(jù)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)中的操作步驟純化目的蛋白，用SDS-PAGE檢測，紫外分光光度儀測定蛋白含量。

1.2.4 雙峰駝FcRn多克隆抗體的制備 將家兔適應(yīng)性飼喂1周后，從耳緣靜脈采集血液并收集血清。將純化后的重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑混勻，充分乳化后，按照800 μg/只的劑量采用背部皮下多點(diǎn)注射方式免疫家兔。1周后將純化后重組蛋白與等量的弗氏不完全佐劑充分乳化，以400 μg/只的劑量在肩胛部及腘淋巴結(jié)多點(diǎn)注射。之后每間隔1周加強(qiáng)免疫1次(方法和劑量同第2次)。待第4次免疫6 d后，心臟采集血液，獲得兔抗雙峰駝FcRn的多抗血清。

1.2.5 雙峰駝FcRn多克隆抗體血清效價(jià)的檢測 將純化的FcRn重組蛋白作為抗原，以5 μg/孔的量4℃過夜包被酶標(biāo)板，經(jīng)洗滌、封閉、洗滌后，加入按1∶2 000～1∶128 000梯度稀釋的血清，37℃孵育1 h，洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶8 000稀釋)，37℃孵育1 h，再次洗滌后在避光條件下加入TMB底物顯色液，顯色15 min后加入2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)(50 μL/孔)，最后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值(OD)。以O(shè)D待測/ OD陰性≥2.1的最高稀釋倍數(shù)作為該多抗血清的效價(jià)。

1.2.6 雙峰駝FcRn多克隆抗體的Western blot分析 將純化后的FcRn重組蛋白經(jīng)常規(guī)120 g/L SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后放至含50 g/L脫脂奶粉的TBS-T 中，37℃封閉2 h后，分別用免疫前兔血清和兔抗血清為一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜；經(jīng)TBS-T洗滌3次，用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶8 000稀釋)室溫孵育2 h，再經(jīng)TBS-T洗滌3次后，滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 雙峰駝FCGRT基因合成與重組質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果

通過對(duì)雙峰駝FcRn蛋白親水性(圖1A)和抗原表位(圖1B)的預(yù)測分析，表明該蛋白為抗原指數(shù)較高的疏水性蛋白；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測FcRn蛋白總共有355個(gè)氨基酸，其中氨基酸1-299為膜外區(qū)(圖2)，利用Editseq (DNASTAR 7.0)截取膜外部分；信號(hào)肽預(yù)測該蛋白氨基酸1-24為信號(hào)肽部分(圖3)，截除信號(hào)肽，剩余275個(gè)氨基酸，然后在上游和下游分別添加起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，最終預(yù)測該FcRn重組蛋白大小為34 ku。

2.2 pET-28a-FcRn重組質(zhì)粒在大腸埃希氏菌中誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式

將重組菌37℃培養(yǎng)至OD 600 nm值為0.8時(shí)，用IPTG(1.0 mmol/L)誘導(dǎo)6 h后收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE檢測重組菌誘導(dǎo)后產(chǎn)物與重組菌誘導(dǎo)前產(chǎn)物相比出現(xiàn)了明顯的表達(dá)條帶(圖4)；超聲破碎離心后，目的條帶只出現(xiàn)在重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物的沉淀中，說明重組蛋白FcRn在BL21中成功表達(dá)，且以包涵體的形式存在，其大小約為34 ku，與預(yù)期相符。

圖1雙峰駝FcRn蛋白親水性與抗原表位的預(yù)測

圖2雙峰駝FcRn蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測

圖3雙峰駝FcRn蛋白信號(hào)肽的預(yù)測

2.3 雙峰駝FcRn重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化和純化結(jié)果

對(duì)重組菌以不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測在此IPTG濃度梯度范圍內(nèi)(0.1 mmol/L～1.0 mmol/L)，IPTG的誘導(dǎo)作用不是很明顯，但相比而言，在IPTG濃度為0.3 mmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)量最多(圖5)，故FcRn重組蛋白表達(dá)的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.3 mmol/L。

對(duì)重組菌以不同的時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(1 h～10 h)，SDS-PAGE檢測在添加0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)1 h時(shí)，就有目的蛋白表達(dá)，隨著時(shí)間的推移，表達(dá)量逐漸增加，6 h時(shí)目的蛋白的表達(dá)量達(dá)到了最高(圖6)，故FcRn重組蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1.重組菌誘導(dǎo)前產(chǎn)物；2～3.重組菌誘導(dǎo)后產(chǎn)物； 4.重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物的上清；5.重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物的沉淀；6.純化后的重組蛋白

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.重組菌誘導(dǎo)前產(chǎn)物； 2～7.0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mmol/L的IPTG濃度誘導(dǎo)的重組菌產(chǎn)物

2.4 雙峰駝FcRn重組蛋白的純化結(jié)果

以最佳表達(dá)條件大批量表達(dá)FcRn重組蛋白，純化時(shí)收集洗脫液，經(jīng)紫外分光光度儀測定其最高蛋白含量為2.544 mg/mL，SDS-PAGE檢測純化后的重組蛋白純度高，無雜蛋白，大小為34 ku(圖7)。

2.5 雙峰駝FcRn多克隆抗體血清效價(jià)的ELISA檢測結(jié)果

用間接ELISA測定抗體效價(jià)，將抗血清與免疫前陰性血清分別以1∶32 000和1∶2 000稀釋時(shí)，OD 450 nm(陽性)/OD 450 nm(陰性)>2.1，說明該抗體血清效價(jià)為1∶32 000。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1.重組菌誘導(dǎo)前產(chǎn)物； 2～11.重組菌被誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h的產(chǎn)物

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～4.純化后的重組蛋白

2.6 雙峰駝FcRn多克隆抗體的Western blot鑒定結(jié)果

Western blot鑒定在膜上約34 ku處有明顯的蛋白印跡出現(xiàn)(圖8)，說明該兔抗雙峰駝FcRn抗體能與重組蛋白特異性結(jié)合，即具有反應(yīng)原性。

1.免疫前兔血清； 2.兔抗血清

3 討論

雙峰駝作為中國西北及華北荒漠、半荒漠地區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)畜種之一，常年生活于干旱多沙和氣溫起伏很大的沙漠環(huán)境中，其懷孕周期(13個(gè)月)和產(chǎn)羔間隔(至少2年以上)長，母駝初配年齡在4歲～5歲，產(chǎn)羔時(shí)間主要于每年的1月～3月，這對(duì)于血液，特別是初乳的采集來說困難極大。2012年由內(nèi)蒙古大學(xué)完成雙峰駝全基因組序列圖譜繪制和破譯工作并在《Nature》系列科學(xué)雜志發(fā)表在線封面文章，隨后由GenBank將雙峰駝全基因組數(shù)據(jù)(Ref Seq GCF-000767855.1)向全球公開釋放。而原核表達(dá)系具有目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短[15]，操作簡單，抗污染能力強(qiáng)，成本相對(duì)較低，遺傳學(xué)、生理學(xué)特性明確等特點(diǎn)，所以用原核表達(dá)系統(tǒng)來制備抗體無疑是最佳的選擇。

新生動(dòng)物Fc受體其本質(zhì)為跨膜蛋白，抗原表位主要集中于膜外部分，為了降低基因合成的成本，故截取膜外部分。另外，本實(shí)驗(yàn)室中未去掉信號(hào)肽的重組蛋白始終無法表達(dá)，而在同等條件下，去掉信號(hào)肽的重組蛋白卻成功表達(dá)。根據(jù)“信號(hào)肽假說”，蛋白質(zhì)分子中的信號(hào)肽是由15個(gè)～30個(gè)氨基酸殘基組成，能引導(dǎo)新合成肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一段疏水性多肽。但在原核表達(dá)的過程中，信號(hào)肽序列中的密碼子對(duì)大腸埃希氏菌來說可能是稀有密碼子，而大腸埃希氏菌中沒有或具有很少量能識(shí)別這些密碼子的tRNA。國內(nèi)早有報(bào)道，在相同條件下，切除信號(hào)肽后能提高重組蛋白的表達(dá)量。

對(duì)雙峰駝FcRn重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響不顯著，而誘導(dǎo)時(shí)間的影響極為顯著，這與文獻(xiàn)[16]的研究結(jié)果相一致。

本研究通過基因合成、原核表達(dá)等方法獲得與預(yù)期大小相符的雙峰駝FcRn重組蛋白，確定其最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.3 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。間接ELISA檢測其效價(jià)為1∶32 000，Western blot鑒定該抗體能與重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，上述結(jié)果證明已成功制備了高效價(jià)和特異性良好的兔抗雙峰駝FcRn多克隆抗體，為進(jìn)一步研究FcRn抗體在雙峰駝黏膜表面的分布奠定了基礎(chǔ)。