劉 智，任 鵬，劉鳳煉，龍 金，陳志濤，石 磊，楊 喆，高曉勤

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 凱里 556000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004)

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅男性身心健康。近年來前列腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年升高[1-2]。迄今為止，關(guān)于前列腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。大量文獻(xiàn)證實(shí)，前列腺癌發(fā)生常與DNA甲基化、雄激素受體基因異化、生長(zhǎng)因子與表皮機(jī)制相互作用以及自噬等有關(guān)[3-5]。其中自噬被認(rèn)為是與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[6]。新近研究證實(shí)，Akt/mTOR信號(hào)通路作為調(diào)控自噬的經(jīng)典通路參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[7]。

姜黃素是一類從姜科草本植物郁金的根所提取得到的酚類物質(zhì)，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤、抗炎、清除自由基、抗氧化等作用[8-9]。本研究旨在探討姜黃素誘導(dǎo)前列腺癌LNCaP細(xì)胞自噬的作用機(jī)制，為前列腺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 LNCaP細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)；姜黃素(純度98%，購(gòu)自Sigama公司)；Akt、pAkt、mTOR、pmTOR抗體、LC3抗體、p62 抗體(購(gòu)自Sigama公司)；MTT Assay試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(購(gòu)自碧云天生物科技有限公司)。流式細(xì)胞儀(購(gòu)自BD公司)；酶標(biāo)儀(購(gòu)自Bio-Teck)；PCR儀(購(gòu)自美國(guó)Thermo公司)；垂直電泳儀(北京百晶生物)；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板等(corning)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(NUAURE)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 用含10%熱滅活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(37℃、5%CO2)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、姜黃素處理組(濃度為10、20、40 μmol/L)。作用24 h后實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 MTT法分析細(xì)胞活性，將LNCaP細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中的培養(yǎng)24 h后，不同濃度姜黃素處理24 h，棄上清，加入100 μl MTT溶液37℃繼續(xù)孵育2 h，再加入100 μl DMSO溶液，震蕩。并于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活性，計(jì)算公式：處理組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù) 采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行量化分析。細(xì)胞接種于培養(yǎng)板24 h后，經(jīng)不同濃度姜黃素處理24 h后。收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，用吖啶橙在4℃下染色15 min。用流式細(xì)胞儀FL1和FL3通道檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。自噬率(%)=(FL3/FL1)×100。

1.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn) LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)姜黃素(0、10、20、40 μmol/L)處理24 h后。用 Trizol試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣本總體積25 μl(包括染料12.5 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、ddH2O28 μl、cDNA 2.5 μl)反應(yīng)條件為：90°C預(yù)變性l0 min，95°C變性10 s，60°C退火20 s，72℃延伸34 s，40個(gè)循環(huán)，β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)各模板的Ct值。以 2-ΔΔCt反映Beclin-1基因相對(duì)表達(dá)量。(Beclin-1上游引物：5’-AAA CCA GAT GCG TTA TGC CC-3’，下游引物：5’-GCG ACC CAG CCT GAA GTT AT-3’；β-actin上游引物：5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，下游引物：5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’)

1.6 Westernblot分析 收集約1×106個(gè)LNCaP細(xì)胞，加入裂解緩沖液冰上裂解30 min，然后蛋白定量。獲取50 μg蛋白在分離膠中進(jìn)行電泳，結(jié)束后將其轉(zhuǎn)膜上，并用牛血清白蛋白封閉2 h。加入相應(yīng)一抗以及二抗，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖的影響 為了評(píng)價(jià)不同濃度姜黃素對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖的影響，本研究首先采用姜黃素(0、10、20、40 mol/L)孵育LNCaP細(xì)胞24 h，之后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，隨著姜黃素劑量增加，對(duì)LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用越顯著，并呈劑量依賴(見圖1)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LNCaP細(xì)胞自噬情況，結(jié)果顯示，姜黃素呈劑量依賴地誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞的自噬反應(yīng)(見圖2)，這提示姜黃素誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞的自噬。

圖1 姜黃素對(duì)LNCaP細(xì)胞增殖抑制率的影響

圖2 姜黃素對(duì)LNCaP細(xì)胞自噬率的影響

2.2 姜黃素對(duì)LNCaP細(xì)胞自噬的影響 采用姜黃素(0、10、20、40 mol/L)孵育LNCaP細(xì)胞24 h后，采用western blot和RT-PCR分別檢測(cè)了Beclin-1蛋白和mRNA表達(dá)的情況，結(jié)果顯示，姜黃素(0、10、20、40 mol/L)劑量依賴地引起細(xì)胞自噬增加(見圖3)。

圖3 姜黃素對(duì)Beclin-1蛋白和mRNA表達(dá)的影響

2.3 姜黃素誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞自噬對(duì)Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響 采用western blotting檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I、p62的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，姜黃素引起LC3II/LC3I比值升高，p62蛋白表達(dá)水平下降，且呈劑量依賴性(見圖4)這些結(jié)果提示姜黃素誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞自噬。檢測(cè)自噬Akt/mTOR信號(hào)通路參與調(diào)控相關(guān)蛋白p-Akt，Akt，p-mTOR和mTOR的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，姜黃素促進(jìn)p-Akt，p-mTOR磷酸化水平下降，并呈濃度依賴(見圖5)，提示Akt/mTOR通路參與姜黃素誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞增殖。

圖4 姜黃素對(duì)LCII/LCI、p62蛋白表達(dá)情況的影響

圖5 姜黃素對(duì)p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響

3 討論

細(xì)胞自噬是目前腫瘤領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，自噬與腫瘤關(guān)系密切，對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起著重要作用[6]。姜黃素是一種植物提取物，近年來姜黃素等天然化合物已成為腫瘤治療中預(yù)防和治療策略的研究熱點(diǎn)。研究證實(shí)，姜黃素能阻斷DAMPs-TLR4信號(hào)通路途徑抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[10]。姜黃素還能顯著降低胃癌的存活率和增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。這些研究提示姜黃素也可能具有抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)自噬的作用，

姜黃素是植物姜黃中根莖中最具生物活性的多酚異黃酮，其顯著的特點(diǎn)是具有抗炎和抗腫瘤特性[12-13]。大量文獻(xiàn)已證實(shí)姜黃素對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展具有化學(xué)預(yù)防作用[14]。其依據(jù)是，姜黃素多種動(dòng)物腫瘤模型上表現(xiàn)出對(duì)致癌作用的多效性抑制作用，尤其在前列腺癌動(dòng)物模型上。其涉及的關(guān)鍵機(jī)制可能包括：(1)小干擾RNA下調(diào)DNA結(jié)合1抑制劑的表達(dá)；(2)腫瘤抑制因子p53的修復(fù)；(3)Nrf2信號(hào)的激活[15]；(4)下調(diào)VEGF表達(dá)[16]；(5)調(diào)節(jié)toll樣受體(TLR)/interleukin-1受體(IL-1R)途徑；(6)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta1(TGF-β1)；(7)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)，例如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2(COX2)；(8)通過下調(diào)Bcl-2并上調(diào)Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]；(9)抑制MMP9[16]。此外還有研究報(bào)道，姜黃素可通過調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞炎癥相關(guān)通路、MAPK、JAK/STAT信號(hào)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。新近研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[15]。Beclin1作為自噬的特異性標(biāo)志物，與自噬過程密切相關(guān)，尤其在自噬的早期。LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化有助于自噬體的形成，LC3II常被認(rèn)為是一種自噬體標(biāo)記物。本研究為了證實(shí)姜黃素對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞系的影響，首先檢測(cè)了姜黃素對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞自噬率，發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制LNCaP細(xì)胞增殖，并發(fā)現(xiàn)這種抑制作用隨著劑量的增加而增強(qiáng)，同時(shí)伴隨細(xì)胞自噬的增強(qiáng)。

Akt/mTOR通路是研究調(diào)控細(xì)胞自噬的經(jīng)典通路，特別是參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展[7]。為了證實(shí)細(xì)胞自噬Akt/mTOR信號(hào)是否參與姜黃素對(duì)LNCaP細(xì)胞的影響，研究檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白Beclin-1，LC3II,，LC3I，p62，p-Akt，Akt，p-mTOR和mTOR的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1，LC3II，LC3I表達(dá)上調(diào)，p62表達(dá)下調(diào)，p-Akt和p-mTOR磷酸化水平下降，這些結(jié)果提示姜黃素可能通過Akt/mTOR通路誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞自噬，這與姜黃素抑制其他類型腫瘤細(xì)胞自噬途徑的文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，姜黃素通過抑制Akt/mTOR分子信號(hào)通路誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞增殖，提示姜黃素是一種潛在的前列腺癌治療的候選藥物。