倪 蓉，梁 健，趙 超，呂述彥

淮安市第一人民醫(yī)院生殖健康與不孕癥科，江蘇 淮安 223300

自然流產(chǎn)是懷孕最常見(jiàn)的并發(fā)癥［1］，在臨床妊娠中自然流產(chǎn)占10%～20%［2-3］，流行病學(xué)證據(jù)表明，遺傳因素在流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［4］。研究表明，50%～60%孕早期流產(chǎn)是由胚胎染色體異常引起，且孕中期妊娠流產(chǎn)中仍有30%是由胚胎染色體異常引起［5-6］。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，其在檢測(cè)流產(chǎn)組織的非整倍體和拷貝數(shù)變異中具有非常高的靈敏度和特異度［7-8］，為流產(chǎn)物的檢測(cè)提供了一種快捷、準(zhǔn)確、高成功率的檢測(cè)手段。本研究以低深度全基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序（copy number variation sequencing，CNV-seq）技術(shù)對(duì)112 例流產(chǎn)物樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)部分流產(chǎn)物結(jié)果異常的父母雙方行外周血染色體核型分析檢測(cè)，以探討CNVseq 技術(shù)在胚胎組織遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值，以期為夫妻雙方再次生育提供遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和指導(dǎo)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

選取2016 年1 月—2018 年12 月在淮安市第一人民醫(yī)院就診的自然流產(chǎn)患者112 例，對(duì)其流產(chǎn)物進(jìn)行全基因組測(cè)序，檢測(cè)均獲患者及家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。孕婦年齡20～45 歲，根據(jù)孕婦年齡分為≥35 歲和＜35 歲組。對(duì)于流產(chǎn)物染色體異?；颊?，征求夫妻雙方同意行外周血染色體核型檢測(cè)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及DNA提取

留取清宮術(shù)后絨毛組織，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水沖洗至無(wú)血水后，將組織樣本剪碎，選取3～5 mg放置離心管內(nèi)，加入180 μL Buffer ATL及20 μL Proteinase K，旋渦混勻，放入56 ℃水浴鍋中消化過(guò)夜。采用天根DNA提取試劑盒提取全基因組DNA，終濃度20 ng/μL。

1.2.2 高通量測(cè)序分析

DNA 文庫(kù)構(gòu)建及熒光定量PCR 分析后，用NextSeq CN500機(jī)器對(duì)樣品DNA 進(jìn)行全基因組測(cè)序（0.1X），測(cè)序數(shù)據(jù)與已知人類(lèi)參考基因組（hg19）序列比較分析，得到匹配序列，計(jì)算待測(cè)樣本的拷貝數(shù)，根據(jù)檢測(cè)值判斷對(duì)應(yīng)染色體檢測(cè)區(qū)域的檢測(cè)結(jié)果。將樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的基因組拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）與人類(lèi)染色體變異數(shù)據(jù)庫(kù)（database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resources，DECIPHER）、基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)（detabase of genomic variants，DGV）以及在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（online mendelian inheritance in man，OMIN）進(jìn)行比對(duì)，分析CNV 的臨床意義。此外利用STR 技術(shù)對(duì)流產(chǎn)物母本外周血及流產(chǎn)組織進(jìn)行STR 分析，排除母源污染和三倍體及多倍體的倍性分析。

2 結(jié)果

在112例流產(chǎn)樣本中，染色體結(jié)果異常共56例（50.0%，56/112）。在56例染色體異常結(jié)果中，染色體數(shù)目異常37 例（66.1%），染色體結(jié)構(gòu)異常12 例（21.4%），嵌合體7例（12.5%）。

2.1 染色體數(shù)目異常

出現(xiàn)異常信號(hào)頻率高的分別是16 三體（27.1%）、45，X（24.3%）、13 三體（10.8%）、18 三體（10.8%）（表1）。

2.2 染色體結(jié)構(gòu)異常

112例流產(chǎn)物樣本中共檢測(cè)出染色體結(jié)構(gòu)異常12 例，共發(fā)現(xiàn)24 個(gè)CNV，最小片段長(zhǎng)度0.24 Mb，最大片段58.90 Mb。在檢測(cè)出的24 個(gè)CNV 中，18 個(gè)CNV有臨床意義。在檢測(cè)出的致病性CNV中，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)包含微缺失微重復(fù)綜合征，即Cridu chatsyndrome 綜合征和Wolf-Hirschhorn Syndrome 綜合征，其中Wolf-Hirschhorn Syndrome 綜合征還伴有12、20 號(hào)染色體部分區(qū)域重復(fù)（表2），經(jīng)該夫妻雙方知情同意后行外周血染色體檢測(cè)，女方為平衡易位攜帶者［46，XX，t（4；12；20），圖1］。12 例流產(chǎn)物染色體結(jié)構(gòu)異?；颊?，其中4 例夫妻雙方行外周血染色體檢測(cè)，除上述1 例女方為平衡易位攜帶者外，其余3 例夫妻雙方外周血染色體檢測(cè)結(jié)果均正常。

表1 染色體數(shù)目異常檢出情況

2.3 嵌合體

112 例流產(chǎn)物樣本中，共檢測(cè)出7 例嵌合體，其中1例為70，XNN，+2［60%］/69，XNN［40%］，為3倍體嵌合體（表3）。

2.4 年齡因素

患者年齡≥35歲發(fā)生染色體異常導(dǎo)致的流產(chǎn)者占63.2%，年齡＜35 歲發(fā)生染色體異常導(dǎo)致的流產(chǎn)者占47.3%，雖然二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異，但≥35歲組的異常率比＜35歲組高15.9%（表4）。

3 討論

CNV-seq 基于二代測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本DNA 進(jìn)行全基因組測(cè)序（0.1X），測(cè)序結(jié)果與人類(lèi)參考基因組進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)生物信息學(xué)分析以發(fā)現(xiàn)受檢樣本可能存在的染色體相關(guān)異常。染色體核型技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測(cè)出自然流產(chǎn)或者胎兒的染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常，是產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［9］。但染色體核型需要培養(yǎng)絨毛細(xì)胞，制片及分析核型時(shí)間較長(zhǎng)，失敗率高。CNV-seq 則彌補(bǔ)了上述缺陷：①檢測(cè)效果好，相比核型分析，其分辨率可達(dá)到100 kb，能發(fā)現(xiàn)更多的致病性CNV；②報(bào)告周期短，10 d 即可出報(bào)告；③操作方便簡(jiǎn)單，4 h即可完成多樣本檢測(cè)，因不需要培養(yǎng)絨毛細(xì)胞，直接獲取絨毛或胎兒組織提取DNA 進(jìn)行測(cè)序，成功率高。但該技術(shù)也存在弊端，例如CNV-seq 技術(shù)無(wú)法發(fā)現(xiàn)染色體相互易位、倒位等染色體平衡性結(jié)構(gòu)重排，也無(wú)法對(duì)包括單親二倍體（uniparental disomy，UPD）在內(nèi)的雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）進(jìn)行檢測(cè)。

表2 染色體結(jié)構(gòu)異常檢出情況

圖1 1例典型復(fù)發(fā)流產(chǎn)孕婦外周血染色體核型分析結(jié)果提示46，XX，t（4；12；20）

表3 嵌合體異常類(lèi)型檢出情況

表4 不同年齡組染色體異常情況［n（%）］

胚胎染色體異常作為自然流產(chǎn)的主要原因，占自然流產(chǎn)的50%～60%［10］，其遺傳變異符合生命進(jìn)化演變的基本特征。從細(xì)胞遺傳學(xué)水平看，DNA的變異主要包括染色體數(shù)目的變異和染色體結(jié)構(gòu)的變異。數(shù)目變異包括染色體組成倍地增加或減少，以及單條染色體的增加或減少；結(jié)構(gòu)變異主要指染色體片段的重復(fù)、缺失、倒位和易位等。本研究中，112 例流產(chǎn)物樣本均培養(yǎng)成功，共發(fā)現(xiàn)染色體異常數(shù)56 例，其中非整倍體37 例（66.1%），出現(xiàn)異常信號(hào)頻率高的分別是16三體（27.1%）、45，X（24.3%）、13 三體（10.8%）、18 三體（10.8%），可見(jiàn)染色體數(shù)目異常是流產(chǎn)的主要原因。此外，未檢測(cè)到1號(hào)和19號(hào)染色體三體，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符［11-12］。因1 號(hào)染色體占人類(lèi)基因組全長(zhǎng)的8%，19 號(hào)染色體具有較高的G+C 含量、高重排率和高復(fù)制率的特點(diǎn)，兩條染色體若發(fā)生非整倍體異常，在妊娠初期（4 周內(nèi)）即可導(dǎo)致胚胎死亡，許多患者會(huì)認(rèn)為是正常月經(jīng)，并不會(huì)引起重視。

染色體結(jié)構(gòu)變異也是自然流產(chǎn)的重要因素［13］，本研究共檢測(cè)出染色體結(jié)構(gòu)異常12 例（10.7%），高于以往研究（6%），究其原因可能是傳統(tǒng)核型分析分辨率低及CNV-seq技術(shù)成功率、分辨率高，能發(fā)現(xiàn)更多CNV。在12 例結(jié)構(gòu)異常中共發(fā)現(xiàn)24 個(gè)CNV，最小片段長(zhǎng)度0.24 Mb，最大片段58.90 Mb，涉及大量功能基因。在檢測(cè)出的24 個(gè)CNV 中，18 個(gè)CNV 有臨床意義，這些致病性的CNV 將導(dǎo)致胚胎/胎兒嚴(yán)重發(fā)育遲緩、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形、心臟異常等。本研究發(fā)現(xiàn)1例Wolf-Hirschhorn Syndrome綜合征，此外還伴隨12、20號(hào)染色體部分區(qū)域重復(fù)，該綜合征患者主要臨床表征為智力障礙，小頭畸形，肌張力減退，癲癇，宮內(nèi)或出生后生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，小于胎齡兒，典型的“希臘頭盔”面容［14］。該夫妻雙方行外周血染色體檢測(cè)，女方為平衡易位攜帶者［46，XX，t（4；12；20）］，建議其再生育時(shí)進(jìn)行植入前遺傳病診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）。此外還發(fā)現(xiàn)1 例Cridu chatsyndrome 綜合征，該綜合征患者主要臨床表征有哭聲小且似貓叫，特殊面容，小頭畸形，精神發(fā)育異常和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等［15］，夫妻雙方未行進(jìn)一步檢查，已生育一健康胎兒，考慮新發(fā)可能性大。染色體微缺失/微重復(fù)綜合征胚胎致死性雖不如染色體數(shù)目異常，僅在臨床表型嚴(yán)重的情況下才會(huì)致死，這主要受遺傳外顯率和表現(xiàn)度的影響，CNV-seq技術(shù)可以快速、高效地檢測(cè)出染色體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的流產(chǎn)，并通過(guò)對(duì)夫妻雙方外周血染色體及對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的檢測(cè)，為再次生育進(jìn)行遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

孕婦年齡為染色體異常的高危因素，隨著二孩政策的實(shí)施，尤其是高齡孕婦的增多，其卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂及有絲分裂過(guò)程中錯(cuò)誤分離和復(fù)制的風(fēng)險(xiǎn)增高，發(fā)生胚胎染色體異常導(dǎo)致流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增大。本研究顯示患者年齡≥35歲發(fā)生染色體異常導(dǎo)致的流產(chǎn)者占63.2%，年齡＜35歲發(fā)生染色體異常導(dǎo)致的流產(chǎn)者占47.3%，雖然二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異，但≥35歲組比＜35歲組異常率高出15.9%，可見(jiàn)年齡因素至關(guān)重要。

綜上所述，CNV-seq 技術(shù)不但能夠高效檢測(cè)出非整倍體和嵌合體，還能高效檢測(cè)出染色體小片段的缺失和重復(fù)，大大提高了染色體異常的檢出率，可為流產(chǎn)病因的分析及夫妻雙方再次生育提供更有價(jià)值的信息。