周 春，呂 紅，張若洋，陳 蓉，蔡 莉，劉太香，石宇鵬，洪 軻，劉成成*，梁文飚*

1江蘇省血液中心，江蘇 南京 210042；2江蘇先聲醫(yī)學(xué)診斷有限公司，江蘇 南京 210042

人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）位于血小板膜糖蛋白上，由GenBank數(shù)據(jù)庫中ITGA2B、ITGB3、GP1BA、ITGA2、GP1BB 和CD109 相關(guān)序列進(jìn)行編碼。在臨床血小板輸注過程中，輸注HPA不匹配的血小板，可導(dǎo)致受血者機(jī)體產(chǎn)生血小板同種抗體，引起同種免疫血小板減少綜合征、輸血后紫癜、血小板輸注無效等輸血不良反應(yīng)［1-4］。盡管血清學(xué)交叉配合試驗可以降低輸血不良反應(yīng)的發(fā)生率，但無法預(yù)防需長期輸注血小板患者同種抗體的產(chǎn)生，因此通過對獻(xiàn)血者和患者進(jìn)行血小板基因分型，為患者提供HPA 基因型相匹配的血小板，可以有效避免血小板特異性免疫反應(yīng)的發(fā)生，提高輸血的療效和安全性，因此建立基于基因配型的血小板捐獻(xiàn)者血型資料庫是解決需長期輸注血小板患者同種免疫反應(yīng)的有效途徑，在臨床輸血應(yīng)用中具有重要意義。本研究的目的就是建立國內(nèi)首個基于MassARRAY 平臺的人HPA1～29W 系統(tǒng)基因分型的質(zhì)譜檢測方法，為血小板的建庫工作提供高效和高性價比的HPA基因分型方法。

1 材料和方法

1.1 材料

12 個插入HPA1-29W 野生型和突變型序列的合成質(zhì)粒以及50 例經(jīng)PCR-SSP 檢測的已知HPA 分型的獻(xiàn)血者樣本。本研究經(jīng)江蘇省血液中心倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者知情同意。

采用全自動核酸提取儀（E.HT01.Z0.0096）及配套的全血DNA 提取試劑盒（K.QX02.B0.1000）（南京中科拜爾公司），384 孔板PCR 擴(kuò)增儀（GenAmp9700，ABI公司，美國），SDx MassARRAY MALDI-TOF質(zhì)譜檢測系統(tǒng)、Complete iPLEX Pro Genotyping Reagent Set（Agena公司，美國），RNase-free Water（貨號為RT121-02，北京天根公司）等。

1.2 方法

1.2.1 HPA1-29W野生型和突變型序列參考質(zhì)粒的構(gòu)建

針對HPA1-29W野生型（A型）和突變型（B型）所有靶點單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）或突變位點［5］（表1）及其兩端100個左右堿基序列設(shè)計插入片段序列，合成后克隆至pUC57載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5，提取質(zhì)粒、酶切鑒定并測序。

1.2.2 基于MassARRAY 平臺的人HPA1-29W 系統(tǒng)基因分型的質(zhì)譜檢測方法的建立

以包含HPA-1a～29a 和HPA-1b～29bw 序列的HPA 基因分型參考質(zhì)粒建立人HPA1-29W 系統(tǒng)基因分型的質(zhì)譜檢測方法，并以50例已知HPA分型的獻(xiàn)血者樣本對該方法進(jìn)行驗證和確認(rèn)。

基因組DNA制備：采用磁珠法提取試劑盒在全自動核酸提取儀上進(jìn)行基因組DNA提取，DNA終濃度為10～200 ng/μL。

多重PCR 擴(kuò)增：使用美國Sequenom 公司Genotyping Tools MassARRAY Assay Design 軟件［6］針對所有靶點SNP 或突變（表1），設(shè)計PCR 擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物（由上海生工公司合成，表2）。將待測的所有樣品信息進(jìn)行排版，每份樣品做2個復(fù)孔，使用多重PCR技術(shù)在384孔板上擴(kuò)增含有目的SNP的DNA 序列，PCR 擴(kuò)增體系為5 μL，包括2 μL待測DNA 樣本（濃度20～50 ng/μL）和3 μL 反應(yīng)體系（含1 μL 0.5 μmol/L PCR 引物工作液，0.8 μL RNasefree Water，0.5 μL 10×Buffer，0.4 μL 25 mmol/L MgCl2，0.1 μL 25 mmol/L dNTP，0.2 μL 5 U/μL Hotstar-Taq）。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃2 min；95 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃1 min，45個循環(huán)；72 ℃5 min；12 ℃保持。

堿性磷酸酶處理：擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物每孔取5 μL 加入核酸外切酶Ⅰ2.5 U，堿性磷酸酶0.5 U 進(jìn)行純化，去除未結(jié)合的dNTP，純化反應(yīng)的條件為：37 ℃40 min；85 ℃5 min；12 ℃保持。

iPLEX單堿基延伸：針對每個靶點SNP設(shè)計1條延伸引物，將混合好的延伸引物加入上述純化后的產(chǎn)物中，以ddNTP 為底物，進(jìn)行單堿基延伸，每個SNP 的等位基因延伸產(chǎn)物僅有末端1 個堿基的差異，單堿基延伸程序如下：94 ℃30 s；94 ℃5 s，（52 ℃5 s、80 ℃5 s，5 個循環(huán)），40 個循環(huán)；72 ℃3 min；12 ℃保持。

核酸質(zhì)譜檢測：利用Nano樹脂板（規(guī)格為6 mg）純化單堿基延伸的產(chǎn)物，并將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到Spectro-CHIP芯片上，進(jìn)行質(zhì)譜檢測，將樣品結(jié)果進(jìn)行聚類，根據(jù)聚類圖進(jìn)行結(jié)果判讀，判讀完成后導(dǎo)出Plate-Data數(shù)據(jù)。同1個SNP的等位基因由于堿基不同導(dǎo)致分子量不同，形成不同的檢測峰而被區(qū)分。

靈敏度分析：利用檢測質(zhì)粒樣品，29 個等位基因共58 個位點，每種分型檢測1 次，計算靈敏度。靈敏度=真陽性結(jié)果/（真陽性結(jié)果+假陰性結(jié)果）×100%。真陽性結(jié)果是質(zhì)粒結(jié)果為非A型、質(zhì)譜結(jié)果也為非A型的數(shù)量。假陰性結(jié)果是質(zhì)粒結(jié)果為非A型、質(zhì)譜結(jié)果為A型的數(shù)量。靈敏度100%為達(dá)標(biāo)。

特異度分析：檢測質(zhì)粒樣品，58 個位點每種分型檢測1次，計算特異度。特異度=真陰性結(jié)果/（真陰性結(jié)果+假陽性結(jié)果）×100%。真陰性結(jié)果為質(zhì)粒結(jié)果為A 型、質(zhì)譜結(jié)果也為A 型的數(shù)量。假陽性結(jié)果為質(zhì)粒結(jié)果為A 型、質(zhì)譜結(jié)果為非A 型的數(shù)量。特異度100%為達(dá)標(biāo)。

表1 人HPA-1～29bw抗原系統(tǒng)的多態(tài)性Table 1 Polymorphisms resulting in human HPA-1 to 29bw systems

重復(fù)性分析：檢測質(zhì)粒樣品，58 個位點每種分型均重復(fù)檢測10 次，檢測一致性，同時計算1 次檢測成功率。一致性100%、1次檢測成功率大于98%為達(dá)標(biāo)。

1.2.3 已知HPA分型樣本的檢測

利用MassARRAY 平臺檢測50 例已知HPA 分型的獻(xiàn)血者樣本，每個樣品重復(fù)檢測1次，分析1次檢測成功率和重復(fù)檢測一致性，并利用一代測序技術(shù)，抽檢其中15 例標(biāo)本的部分檢測位點，檢驗質(zhì)譜分析技術(shù)對獻(xiàn)血者樣本分型的靈敏度和特異度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。獻(xiàn)血者抽檢標(biāo)本的一代測序檢測結(jié)果與質(zhì)譜檢測結(jié)果的比較采用四格表配對卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPA1-29W野生型/突變型序列參考質(zhì)粒的構(gòu)建

共合成12個插入HPA1-29W野生型/突變型序列的參考質(zhì)粒（生工生物工程股份有限公司，工作編號DA2938-DA2949），插入片段大小為683～1 005 bp，合成質(zhì)粒序列及測序結(jié)果如下（以DA2938質(zhì)粒為例）。

表2 HPA-1～29bw擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物序列Table 2 Primer sequences of HPA-1-29bw amplification and single base extension

克隆至pUC57質(zhì)粒中野生型HPA-1、HPA-10、HPA-2、HPA-5 和HPA-6 的插入序列（下劃線部分為SNP）：5′-TTAGCTATTGGGAAGTGGTAGGGCCT GCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGC TGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTG CCTCTGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGA ATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATC GAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGG ACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAG CTCCCAGGTCACTCAAGTCAGTCCCCAGAGGATTG CACTCCGGCTCCGGCCAGGTCTGACCTCGCTGCCT CTTGGTGCCCTGCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGA GCTCTACCTGAAAGGCAATGAGCTGAAGACCCTG CCCCCAGGGCTCCTGACGCCCACACCCAAGCTGG AGAAGCTCAGTCTGGCTAACAACAACTTGACTGA GCTCCCCGCTGGGCTCCTGAATGGGCTGGAGAAT CTCGACACCCTTCTCGGATAAAGACACCATTACAG ACGTGCTCTTGGTAGGTGCACCAATGTACATGAGT GACCTAAAGAAAGAGGAAGGAAGAGTCTACCTGT TTACTATCAAAGAGGTAAAAAAAAAAAAATAAAC TAATAGTTTAATTTGCTTTAGTACTGGTAATTTAA CTTGCATTTGGAAAGAAAAATTTATTATTATTGAA TGATAATTGAGTGTGGGGTATGCCGTTGTGGGCCT GGCTGGCTGGGATCCCAGTGTGAGTGCTCAGAGG AGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAATGCAG CCCCCGGGAGGGTCAGCCCGTCTGCAGCCAGCGG GGCGAGTGCCTCTGTGGTCAATGTGTCTGCCACAG CAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGCGAG-3′。

DA2938質(zhì)粒中野生型HPA-1、HPA-10、HPA-2、HPA-5 和-HPA-6 插入序列的測序圖經(jīng)酶切鑒定，DA2938 質(zhì)粒測序分析結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中公布的序列完全一致（圖1），為野生型HPA-1、HPA-10、HPA-2、HPA-5和HPA-6。

2.2 MassARRAY MALDI-TOF 質(zhì)譜檢測和一代測序HPA分型

以HPA-15為例，MassARRAY MALDI-TOF質(zhì)譜檢測和一代測序HPA 分型見圖2。DA2943 質(zhì)粒含野生型HPA-15、HPA-17、HPA-18、HPA-20、HPA-22的SNP 位點及兩端相關(guān)序列，質(zhì)譜和一代測序的檢測結(jié)果均為HPA-15a型。

2.3 參考質(zhì)粒的質(zhì)譜分析

質(zhì)粒樣品的靈敏度檢測：29個位點每種分型檢測1 次，共計87 個分型結(jié)果。其中A 型結(jié)果定義為陰性，共29個，非A型（A型和AB型）結(jié)果定義為陽性，其中B型29個、AB型29個，共58個。實際檢測真陽性結(jié)果58 個，假陰性結(jié)果0 個，靈敏度=58/58×100%=100%。

質(zhì)粒樣品的特異度檢測：29個位點每種分型檢測1次，共計87個分型結(jié)果。其中A型結(jié)果（29個）定義為陰性，非A 型（B 型29 個和AB 型29 個）結(jié)果定義為陽性。實際檢測真陰性結(jié)果29個，假陽性結(jié)果0個，特異度=29/29×100%=100%。

圖1 DA2938質(zhì)粒的測序結(jié)果Figure 1 Sequencing results of DA2938 plasmid

圖2 DA2943質(zhì)粒HPA-15質(zhì)譜和一代測序結(jié)果示意圖Figure 2 Schematic diagram of HPA-15 mass spectrometry and first generation sequencing of DA2943 plasmid

質(zhì)粒樣品的重復(fù)性檢測：29個位點每種分型均重復(fù)檢測10次，共計870個分型結(jié)果，其中A型結(jié)果290個，B型結(jié)果290個，AB型結(jié)果290個，檢測一致性為100%，1次檢測成功率為100%。

2.4 已知HPA分型樣本的質(zhì)譜分析

預(yù)期獲得1 450個數(shù)據(jù)，實際檢測中有1個數(shù)據(jù)未檢出。1 次檢測成功率=1 449/1 450×100%=99.93%。

50例樣品重復(fù)檢測一致性：除未檢出的1例結(jié)果，其他所有結(jié)果2 次重復(fù)均一致，一致性=1 448/1 450×100%=99.86%。

15 例抽樣樣品的部分抽檢位點一代測序與質(zhì)譜檢測結(jié)果：共隨機(jī)抽取15例樣品和127個位點進(jìn)行一代測序和質(zhì)譜分析，共有真陽性結(jié)果（質(zhì)譜結(jié)果為非A型、測序結(jié)果也為非A型）21例，假陽性結(jié)果（質(zhì)譜結(jié)果為A型、測序結(jié)果為非A型）0例，假陰性結(jié)果（質(zhì)譜結(jié)果為非A型、測序結(jié)果為A型）0例，真陰性結(jié)果（質(zhì)譜結(jié)果為A 型、測序結(jié)果也為A 型）106 例，靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%=21/（21+0）×100%=100%，特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%=106/（106+0）×100%=100%，2 種方法檢測結(jié)果的一致性為100%（表3）。

3 討論

人血小板上存在多種抗原，引起患者發(fā)生同種免疫的抗原主要是ABO 血型抗原、HLA-Ⅰ類抗原、CD36 和HPA。在衛(wèi)生行政部門頒布的《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》以及衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 623-2018《全血和成分血使用》中，只規(guī)定血小板輸注需按照ABO同型或相合原則輸注，致使多次隨機(jī)輸注血小板的患者容易產(chǎn)生相應(yīng)的HLA、CD36和HPA抗體，造成免疫性血小板輸注無效。僅就HPA系統(tǒng)而言，國際血小板命名委員會近年來已正式命名了35 個用血清學(xué)檢出的血小板抗原，并將35 個HPA 分為29 個系統(tǒng)（或準(zhǔn)系統(tǒng)），其中HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-15 組成雙等位基因的抗原系統(tǒng)，其他抗原均未檢出對偶抗原［5，7-8］。從理論上說，每個HPA 系統(tǒng)的抗原都可以引發(fā)特異性HPA 抗體介導(dǎo)的免疫性血小板輸注無效，因此血小板捐獻(xiàn)者血型資料庫范圍最好涵蓋上述29 個HPA 系統(tǒng)。國內(nèi)迄今尚未對血小板捐獻(xiàn)者HPA 基因型資料庫的建庫工作形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各地根據(jù)當(dāng)?shù)貙嶋H情況和從衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)的角度出發(fā)，在建庫過程中有選擇性地對捐獻(xiàn)者的HPA 系統(tǒng)進(jìn)行基因分型，主要有檢測HPA1～6、HPA-15、HPA-21w模式，HPA-1～17w模式、HPA-1～21w 模式或者其他模式［9］。國內(nèi)對HPA1-28bw的研究已有報告［1］，但HPA-29w在中國人群中的分布尚未見報道，出于研究中國人群HPA1-29bw多態(tài)性分布以及滿足患者長期臨床治療效果考慮，我們在建庫中采用HPA1～29bw的分型模式。

表3 一代測序和質(zhì)譜分型技術(shù)對15 例樣品的HPA 分型結(jié)果Table 3 HPA typing results of 15 samples by first generation sequencing and mass spectrometry（n）

HPA 數(shù)據(jù)庫的建庫規(guī)模很大程度上取決于HPA 系統(tǒng)中bb 純合子的基因頻率。報道在浙江漢族人群中獲取1個HPA-1系統(tǒng)的bb純合子，理論上需要篩查20 408名供者［9］，而浙江漢族人群HPA-1b等位基因頻率（0.007 5）［1］遠(yuǎn)高于HPA-4b 等位基因頻率（0.003 0），獲取HPA-4bb純合子需要篩查更多供者。另外，國人在EMBL 數(shù)據(jù)庫中有極低頻率的HPA-10bw（0.000 5）［10］，還在江蘇漢族人群中發(fā)現(xiàn)1 例國內(nèi)尚未見報道的HPA-11bw，其等位基因頻率比HPA-10bw 更低（結(jié)果尚未公開報道），這些低頻HPA對建庫庫容提出了更高標(biāo)準(zhǔn)，如果考慮ABO血型抗原、HLA和CD36的因素，血小板捐獻(xiàn)者基因型資料庫的庫容必須具備足夠大的規(guī)模才能夠滿足臨床需求。據(jù)統(tǒng)計，2017年國內(nèi)血小板獻(xiàn)血者HLA和HPA基因型數(shù)據(jù)庫共登記25 240人的分型資料，但當(dāng)年HLA或HPA基因型配合應(yīng)用總和僅137例［11］，其原因之一就是受制于庫容這一瓶頸。可以預(yù)期未來建立血小板捐獻(xiàn)者基因型資料庫的規(guī)模和投入的人力物力是相當(dāng)可觀的，因此建庫所選擇的HPA基因分型方法，最好在兼顧檢測準(zhǔn)確度和檢測通量的前提下，符合衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)的要求。

盡管HPA的基因頻率分布在不同種族、不同區(qū)域中存在差異，但HPA 多態(tài)性的分子基礎(chǔ)已經(jīng)闡明，除了HPA-14w 的AAG 三聯(lián)體缺失導(dǎo)致的突變外，大多數(shù)抗原發(fā)生的變異主要是編碼這些糖蛋白基因的SNP 引起的［5］，造成了對應(yīng)蛋白質(zhì)中氨基酸的改變和血小板表面的糖蛋白多態(tài)性，這為已知血小板變異的基因分型提供了基礎(chǔ)。目前HPA基因分型檢測方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)核苷酸特異性引物技術(shù)（PCR-SSP）、核苷酸序列測定法（PCR-SBT）、基于Luminex的聚合酶鏈反應(yīng)序列特異性寡核苷酸探針技術(shù)（PCR-SSO）、實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）、吸電離飛行時間質(zhì)譜分析（MALDI-TOFMS）以及下一代測序技術(shù)（NGS）等［1，12-13］；以上分型方法均存在檢測通量低、成本高以及自動化程度低等缺陷，不利于開展大規(guī)模的建庫工作。MassARRAY核酸質(zhì)譜陣列基因分析系統(tǒng)是一個功能強(qiáng)大的核酸質(zhì)譜定性定量平臺，它完美地結(jié)合了質(zhì)譜檢測的高分辨率、PCR 擴(kuò)增的高敏感度以及生物芯片技術(shù)的高通量，無需雜交及熒光染料等二級標(biāo)記物，直接以分子量為標(biāo)記對樣本進(jìn)行多方位分析，具有位點選擇靈活、檢測結(jié)果可靠、檢測通量高、檢測成本低的優(yōu)點［14-16］。MassARRAY 技術(shù)的檢測成本遠(yuǎn)低于PCR-SBT 和NGS，而檢測通量遠(yuǎn)高于上述2 個測序技術(shù)，且定制靈活，可以自由選擇感興趣的SNP位點進(jìn)行設(shè)計，因此從技術(shù)性能和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)的角度，MassARRAY 核酸質(zhì)譜陣列基因分析系統(tǒng)是最適合血小板供者資料庫構(gòu)建的分型技術(shù)。

本研究采用12 個插入HPA-1～29w 野生型和突變型序列的參考品質(zhì)粒建立基于MassARRAY 平臺的人HPA1-29W系統(tǒng)基因分型技術(shù)，50例血液基因組DNA樣品質(zhì)譜檢測結(jié)果表明，其臨床靈敏度和特異度均為100%，重復(fù)檢測的一致性均為100%，1次檢測成功率為99.93%，符合預(yù)期制定的定制化檢測HPA位點的各項性能指標(biāo)。綜上所述，本研究建立了國內(nèi)首個基于MassARRAY 平臺、人HPA1-29W系統(tǒng)基因分型的質(zhì)譜檢測方法，可以為血小板捐獻(xiàn)者血型資料庫構(gòu)建工作提供高效和高性價比的HPA基因分型手段，不僅可以提高輸血的療效和安全性，減少血小板輸注無效的發(fā)生，還能夠有效降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、節(jié)約寶貴的血液資源。