麥綺瑩，范亞葦，鄧澤元，張 兵

（1.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

花青素又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于類黃酮化合物，多以糖苷的形式存在。矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）是食品中分布最廣泛的花青素。C3G能夠表現(xiàn)出自由基清除活性[1]，具有抗炎[2]、抗癌[3]、預(yù)防肥胖[4]、改善高血糖癥[5]和預(yù)防心血管疾病[6]等功效。C3G的生物活性取決于其生物利用度，且與其穩(wěn)定性和存在環(huán)境息息相關(guān)。關(guān)于花青素生物活性和生物利用度的研究通常采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。體外細(xì)胞培養(yǎng)中，花青素單體或富含花青素的提取物通常在各種細(xì)胞模型中孵育幾個(gè)小時(shí)或者長(zhǎng)達(dá)幾天。然而，花青素穩(wěn)定性差，易受溫度、光照、pH值等環(huán)境因素影響而降解[7]，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。但目前為止，大多數(shù)采用細(xì)胞模型研究花青素生物活性的報(bào)道常會(huì)忽略這些影響；此外，已有研究發(fā)現(xiàn)單個(gè)化合物可能會(huì)在細(xì)胞中進(jìn)行局部代謝，或者在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，化學(xué)穩(wěn)定性可能會(huì)有所變化[8]。因此，研究細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要成分——胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響有重要的意義。

FBS是細(xì)胞和組織培養(yǎng)基的通用生長(zhǎng)補(bǔ)充劑。血清是一種天然復(fù)合物，含有1 800多種蛋白質(zhì)和4 000多種代謝產(chǎn)物[9]，其中牛血清白蛋白是FBS中的主要蛋白質(zhì)。目前大部分的研究表明，多酚類化合物與各種蛋白質(zhì)（如牛血清白蛋白[10]、大豆分離蛋白[11]、β-乳球蛋白[12]等）存在相互作用，從而影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象；此外，它們的相互作用還會(huì)提高多酚類化合物的穩(wěn)定性，保持其抗氧化性，起到保護(hù)作用。已有研究表明，F(xiàn)BS能與21 種白藜蘆醇類似物相互作用，且其相互作用與白藜蘆醇類似物和牛血清白蛋白之間的親和力存在正相關(guān)關(guān)系，F(xiàn)BS還會(huì)掩蓋白藜蘆醇類似物的抗氧化活性[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究C3G在不同細(xì)胞培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定性，同時(shí)探究FBS與C3G在細(xì)胞培養(yǎng)條件下的相互作用機(jī)制及對(duì)其抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C3G和原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）（純度均大于98%）北京索萊寶科技有限公司；間苯三酚醛（phloroglucinaldehyde，PGA）（純度大于95%）山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ehylbenzthiazoline-6-solfonic acid) diammonium salt，ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）成都西亞化工股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS以色列Biological Industries公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜級(jí)）德國(guó)默克色譜試劑公司；甲酸（色譜級(jí)）美國(guó)Acros公司；甲醇、乙醇、鹽酸、冰醋酸、三水醋酸鈉、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和FeCl3·6H2O西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GPST200型CO2恒溫培養(yǎng)箱長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司；JY-86-2-50型-80 ℃冰箱香港力康發(fā)展有限公司；LG J-15D冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)儀器有限公司；AL104型電子天平瑞士梅特勒-托利多儀器公司；BioTek酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司；1260型超高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司；F-7000型熒光分光光度計(jì)日本日立公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；MOS 450圓二色光譜儀法國(guó)Bio Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 C3G在細(xì)胞培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性和降解模型構(gòu)建

C3G在細(xì)胞培養(yǎng)基中穩(wěn)定性測(cè)定：將C3G溶解在DMSO溶液中，以獲得0.2 mol/L的C3G標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用RPMI 1640培養(yǎng)基和含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基（RPMI+10% FBS）分別將C3G的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至1×10-4mol/L，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。分別在0、0.5、1、2、4、6、8、10 h和12 h時(shí)取出1 mL樣品，并立即用色譜級(jí)甲酸調(diào)pH值至2.0，置于-80 ℃冰箱備用。

C3G相對(duì)含量和PGA濃度的測(cè)定：采用超高壓高效液相色譜法，使用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸-水溶液（A）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～4 min，10%～17% B；4～7 min，17%～35% B；7～8 min，35%～100% B；8～10 min，100%～10% B。進(jìn)樣量1 0 μ L、柱溫3 0 ℃、流速0.3 m L/m i n、檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm和520 nm。

C3G降解動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建：參照龔輝等[14]的方法，釆用試錯(cuò)法構(gòu)建降解動(dòng)力學(xué)模型，具體原理是：假設(shè)動(dòng)力學(xué)級(jí)數(shù)為零、一、二、三級(jí)，則反應(yīng)物質(zhì)量濃度ρ、反應(yīng)物質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)lnρ、反應(yīng)物質(zhì)量濃度的倒數(shù)1/ρ和反應(yīng)物質(zhì)量濃度的倒數(shù)平方1/ρ2與時(shí)間t呈線性關(guān)系，其中相應(yīng)線性回歸系數(shù)最高的模型為C3G降解動(dòng)力學(xué)模型。

1.3.2 熒光光譜測(cè)定

使用熒光猝滅法測(cè)定C3G與蛋白質(zhì)的非共價(jià)結(jié)合能力。用0.1 mol/L PBS制備體積分?jǐn)?shù)0.25% FBS工作溶液，準(zhǔn)確移取2.0 mL工作溶液于石英熒光池中，在不同溫度（298、304、310 K）條件下測(cè)定連續(xù)添加2 μL C3G溶液（5×10-3mol/L）后，該樣品在波長(zhǎng)300～500 nm區(qū)間內(nèi)的熒光發(fā)射光譜，并測(cè)定樣品在298 K溫度下在波長(zhǎng)250～350 nm區(qū)間內(nèi)Δλ＝15、60 nm的同步熒光光譜。其中，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm、激發(fā)狹縫2.5 nm、發(fā)射狹縫2.5 nm。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

將FBS和含有5×10-5mol/L C3G的混合溶液分別于冷凍干燥機(jī)中凍干。然后將凍干的粉末與KBr以1∶150的質(zhì)量比混合，壓制成片劑后進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜測(cè)定。掃描波長(zhǎng)范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32，分辨率8 cm-1。

1.3.4 圓二色光譜測(cè)定

使用分光旋光儀在遠(yuǎn)紫外線區(qū)域（190～240 nm）測(cè)定樣品的圓二色光譜。用PBS（pH 7.4）配制體積分?jǐn)?shù)0.25% FBS工作溶液，其蛋白質(zhì)量濃度為0.103 mg/mL，用此工作溶液配制C3G濃度為5×10-5mol/L的樣品液，將樣品液和體積分?jǐn)?shù)0.25% FBS工作溶液在光程為0.1 cm的石英比色皿中進(jìn)行測(cè)定。掃描速率60 nm/min、光譜分辨率0.2 nm、響應(yīng)間隔0.25 s、帶寬1.0 nm。

1.3.5 抗氧化性測(cè)定

1.3.5.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率測(cè)定

參照Peng Han等[15]的方法測(cè)定ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。將5 mL ABTS儲(chǔ)備液（7.0×10-3mol/L）與88 μL K2S2O8（0.14 mol/L）混勻，室溫黑暗條件下靜置12～16 h，得到實(shí)驗(yàn)用ABTS儲(chǔ)備液。使用時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液將吸光度調(diào)至0.70±0.05，然后于96 孔板中分別加入20 μL樣品溶液和200 μL ABTS溶液，振蕩混勻6 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按公式（1）計(jì)算。

式中：A0為樣品溶劑和ABTS溶液混合液的吸光度；Ai為樣品溶液和ABTS溶液混合液的吸光度；Aj為樣品溶液和體積分?jǐn)?shù)80%乙醇混合液的吸光度。

1.3.5.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

參照Li Hongyan等[16]的方法測(cè)定DPPH自由基清除能力。稱取一定量的DPPH溶解于甲醇溶液中，避光靜置30 min配制成1.0×10-4mol/L DPPH儲(chǔ)備液，用無(wú)水甲醇將吸光度調(diào)至0.70±0.05，然后于96 孔板中分別加入20 μL樣品溶液和100 μL DPPH溶液，室溫下避光振蕩混勻30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除率按公式（2）計(jì)算。

式中：A0為樣品溶劑和DPPH溶液混合液的吸光度；Ai為樣品溶液和DPPH溶液混合液的吸光度；Aj為樣品溶液和無(wú)水甲醇混合液的吸光度。

1.3.5.3 總還原能力測(cè)定

參照鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）試劑盒法測(cè)定總還原能力：0.3 mol/L醋酸鈉緩沖溶液、2.0×10-2mol/L三氯化鐵溶液和1.0×10-2mol/L TPTZ溶液按10∶1∶1的體積比進(jìn)行混合，配制成FRAP工作液。將10 μL樣品與300 μL FRAP工作液混合，室溫下反應(yīng)4 min，并在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8軟件和GraphPad Prism 6軟件繪制圖表。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析法和Duncan多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 C3G在細(xì)胞培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性

經(jīng)過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，可知圖1A、B中的峰1為PCA，峰2為C3G，峰3為PGA。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，C3G的峰高和峰面積都有所下降，且有新的峰（峰1、3）產(chǎn)生，表明C3G的含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且C3G會(huì)降解成PCA和PGA，這與de Ferrars等[17]的研究結(jié)果相一致。圖2A、B分別為C3G相對(duì)含量和其降解產(chǎn)物PGA濃度在0～12 h中的變化情況。C3G在RPMI+10% FBS中孵育12 h后，相對(duì)含量?jī)H為0 h時(shí)的73.78%，而其降解產(chǎn)物PGA的濃度為2.50×10-6mol/L，在RPMI中孵育12 h后，C3G的相對(duì)含量為0 h時(shí)的54.97%，PGA的濃度為3.14×10-6mol/L。結(jié)果顯示，C3G在含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI培養(yǎng)基中比RPMI培養(yǎng)基中穩(wěn)定，表明FBS使C3G更加穩(wěn)定，其原因可能是C3G與FBS中的蛋白大分子相互作用，形成非共價(jià)化合物，從而提高了C3G的穩(wěn)定性。Xiao Jianbo等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)多酚在細(xì)胞培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性不同于在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，多酚在細(xì)胞培養(yǎng)基中穩(wěn)定性因素包括初始濃度、溫度、蛋白質(zhì)濃度以及pH值，而其在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性主要取決于初始濃度和溫度。He Zhiyong等[12]研究發(fā)現(xiàn)錦葵素-3-葡萄糖苷能與β-乳球蛋白非共價(jià)結(jié)合，Tang Lin等[18]研究發(fā)現(xiàn)C3G能與血清白蛋白、血紅蛋白和肌紅蛋白非共價(jià)結(jié)合。這些研究結(jié)果都表明C3G能通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用影響自身的穩(wěn)定性。

圖 1 280 nm波長(zhǎng)處C3G在不同細(xì)胞培養(yǎng)條件下孵育不同時(shí)間的超高效液相色譜圖Fig. 1 UPLC of C3G at 280 nm at different incubation times under different cell culture conditions

圖 2 不同細(xì)胞培養(yǎng)條件下C3G相對(duì)含量（A）及其主要代謝物PGA濃度（B）的變化Fig. 2 Changes in concentrations of C3G (A) and its major metabolite PGA (B) under different cell culture conditions

2.2 C3G降解動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

圖 3 C3G降解動(dòng)力學(xué)分析Fig. 3 Kinetic analysis of C3G degradation

表 1 C3G降解動(dòng)力學(xué)擬合方程的線性回歸系數(shù)Table 1 Fitting equations of C3G degradation kinetics with correlation coefficients

表 2 C3G零級(jí)模型降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Zero-order kinetic parameters of C3G degradation

圖3為C3G在不同培養(yǎng)條件下的降解動(dòng)力學(xué)模型，根據(jù)試錯(cuò)法計(jì)算出C3G質(zhì)量濃度ρ、lnρ、1/ρ、1/ρ2與時(shí)間t的相關(guān)系數(shù)，線性相關(guān)系數(shù)最大對(duì)應(yīng)的模型為其降解動(dòng)力學(xué)模型。由表1可知，C3G在RPMI+10% FBS和RPMI中的降解模型均符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。目前研究表明，花青素在不同條件下的降解動(dòng)力學(xué)模型主要可分為零、一、二級(jí)和復(fù)雜反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[19]。龔輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素-3-葡萄糖苷、C3G、天竺葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷的超聲降解均符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。黑果枸杞[20]和石榴汁[21]的花青素?zé)峤到饧白细适韀22]中的花青素在不同儲(chǔ)存溶液中的降解均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。Contreras-Lopez等[23]研究發(fā)現(xiàn)黑莓花青素的光降解符合二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。以上研究表明，花青素的降解動(dòng)力學(xué)模型與所處條件有關(guān)，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C3G在細(xì)胞培養(yǎng)條件下的降解符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，這可能與RPMI培養(yǎng)基的復(fù)雜成分有關(guān)。由表2可知，在零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型下，C3G在RPMI+10% FBS和RPMI中的反應(yīng)速率常數(shù)k分別為1.089 2 μg/（mL·h）和1.830 7 μg/（mL·h），其早期降解時(shí)間和半期降解時(shí)間分別為4.97 h和22.85 h，而在RPMI中分別為2.84 h和13.43 h，以上結(jié)果表明，F(xiàn)BS能夠提高C3G在細(xì)胞培養(yǎng)中的穩(wěn)定性。

2.3 C3G對(duì)FBS的熒光猝滅作用及機(jī)理

FBS中含有多種蛋白質(zhì)，其中牛血清白蛋白的含量最為豐富，而牛血清白蛋白因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基而具有較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。圖4為298 K下不同濃度C3G對(duì)FBS的熒光猝滅光譜，結(jié)果顯示，隨C3G濃度的增加，F(xiàn)BS在344 nm波長(zhǎng)處的最大熒光發(fā)射峰強(qiáng)度有規(guī)律地降低，表明C3G與FBS的相互作用使內(nèi)源熒光猝滅，并且該猝滅作用具有濃度依賴性。但是C3G對(duì)FBS的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有影響，說(shuō)明C3G并未改變色氨酸殘基微環(huán)境的極性。

熒光猝滅可以是動(dòng)態(tài)猝滅，也可以是靜態(tài)猝滅。其中，動(dòng)態(tài)猝滅由熒光團(tuán)和猝滅劑的碰撞引起，靜態(tài)猝滅由熒光團(tuán)和猝滅劑之間形成基態(tài)不發(fā)光的復(fù)合物引起，兩者都遵循Stern-Volmer方程，即F0/F＝1+Kqτ0[Q]＝1+KSV[Q]，式中：F0和F分別為C3G不存在與存在時(shí)的熒光強(qiáng)度；Kq為生物大分子的猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為不存在C3G時(shí)的熒光壽命，生物大分子的熒光壽命約為10-8s；KSV為Stern-Volmer方程的猝滅常數(shù)/（L/mol）；[Q]為C3G的濃度/（mol/L）。圖5為不同溫度下F0/F-[Q]關(guān)系圖，可以看出FBS在不同溫度下的Stern-Volmer曲線都具有良好的線性相關(guān)性。由表3可知，F(xiàn)BS在不同溫度下的Kq數(shù)量級(jí)均為1012，遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2×1010L/（mol·s），表明對(duì)FBS的熒光猝滅過(guò)程是以靜態(tài)猝滅為主。靜態(tài)猝滅過(guò)程隨溫度升高可能會(huì)引起配合物的穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致猝滅常數(shù)隨之減小[24]，由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，猝滅常數(shù)KSV隨溫度的升高而逐漸減小，進(jìn)一步說(shuō)明其猝滅過(guò)程是以靜態(tài)猝滅為主。Tang Lin等[25]研究發(fā)現(xiàn)C3G對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖 4 不同濃度C3G對(duì)FBS熒光光譜的影響Fig. 4 Effect of C3G concentrations on fluorescence spectrum of fetal bovine serum

圖 5 不同溫度下C3G對(duì)FBS熒光猝滅的Stern-Volmer圖Fig. 5 Stern-Volmer plots for fluorescence quenching of fetal bovineserum by C3G at different temperatures

表 3 C3G和FBS相互作用的Stern-Volmer常數(shù)Table 3 Stern-Volmer constants for interaction between C3G and fetal bovine serum

2.4 C3G與FBS結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和熱力學(xué)參數(shù)

圖 6 不同溫度下C3G對(duì)FBS熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線Fig. 6 Plots of lg[(F0-F)/F] against lg[Q] derived from the quenching of fetal bovine serum by C3G at different temperatures

表 4 C3G和FBS的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)及其熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Biding constant, binding site number and thermodynamic parameters for interaction between C3G and fetal bovine serum

對(duì)于靜態(tài)猝滅，可由雙對(duì)數(shù)公式求出其結(jié)合反應(yīng)的表觀結(jié)合常數(shù)Ka與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n：lg[（F0-F）/F]＝lgKa+nlg[Q]，式中：Ka為C3G與FBS相互作用的結(jié)合常數(shù)，n為每個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。圖6為lg[（F0-F）/F]-lg[Q]關(guān)系圖，可根據(jù)其直線斜率算出C3G和FBS的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，根據(jù)截距算出lgKa。由表4可知，C3G和FBS的結(jié)合常數(shù)Ka隨溫度的升高而增大，表明其結(jié)合能力隨溫度的升高而加強(qiáng)，并且該結(jié)合過(guò)程是吸熱過(guò)程，而在不同溫度下，其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均接近1，表明C3G在FBS上僅存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，形成1∶1的結(jié)合物，且兩者間存在較強(qiáng)的結(jié)合力。

藥物等小分子與蛋白等生物大分子之間的相互作用力主要有氫鍵、范德華力、疏水作用力和靜電引力4 種，可通過(guò)熱力學(xué)方程lnKa＝-ΔH/RT+ΔS/R、ΔG＝ΔHTΔS＝-RTlnKa算出C3G和FBS相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，式中：Ka為C3G與FBS相互作用的結(jié)合常數(shù)；ΔH為焓變；ΔS為熵變；ΔG為吉布斯自由能變；R為氣體常數(shù)，R＝8.314（J/（mol·K））；T為溫度。Ross等[26]總結(jié)得出：如果ΔH＞0、ΔS＜0，則靜電引力和疏水作用力是主要力；如果ΔH＞0、ΔS＞0，則疏水作用力是主要的結(jié)合力；如果ΔH＜0、ΔS＜0，則范德華力或氫鍵可能在結(jié)合過(guò)程中起主要作用；如果ΔH＜0、ΔS＞0，則主要作用力是靜電引力。由表4可知，ΔG＜0，表明該反應(yīng)是一個(gè)自由能降低的自發(fā)進(jìn)行的過(guò)程，而ΔH和ΔS均大于0，說(shuō)明C3G和FBS相互作用時(shí)，是熵驅(qū)動(dòng)的吸熱反應(yīng)，且疏水作用力是該反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力。

2.5 C3G對(duì)FBS構(gòu)象的影響

同步熒光法與常用熒光測(cè)定方法最大的區(qū)別是激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器波長(zhǎng)是同時(shí)掃描的，由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)與對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)（或發(fā)射波長(zhǎng)）構(gòu)成光譜圖，稱為同步熒光光譜。同步熒光法具有簡(jiǎn)化光譜、窄化譜帶和減小光譜重疊等優(yōu)點(diǎn)，且可以反映蛋白質(zhì)中發(fā)光基團(tuán)所處微環(huán)境的極性和疏水性變化情況，故被常用來(lái)探討小分子藥物對(duì)大分子蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響[27]。Δλ在15 nm和60 nm波長(zhǎng)處，熒光光譜分別提供了酪氨酸和色氨酸殘基的特征信息。由圖7可知，隨著C3G濃度的增加，Δλ在15 nm和60 nm波長(zhǎng)處的最大熒光發(fā)射峰強(qiáng)度不斷降低，但是波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，表明C3G與FBS的相互作用并沒(méi)有明顯改變酪氨酸和色氨酸殘基的微環(huán)境及其構(gòu)象，與吸收光譜的結(jié)論一致。

圖 7 FBS在Δλ為15（A）、60 nm（B）波長(zhǎng)處的同步熒光光譜Fig. 7 Synchronous fluorescence spectra of fetal bovine serum at Δλ of 15 (A) and 60 nm (B)

2.6 C3G對(duì)FBS二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外光譜具有檢測(cè)氫鍵變化的功能，且十分靈敏，因而經(jīng)常被用來(lái)檢測(cè)小分子作用對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。酰氨吸收帶因蛋白質(zhì)在不同波數(shù)范圍內(nèi)的吸收峰及出峰原因主要分為I、II帶和III帶。其中，酰氨I帶（1 700～1 600 cm-1）是氨基酸殘基的C＝O伸縮振動(dòng)引起；酰氨II帶（1 600～1 500 cm-1）是由C—N伸縮振動(dòng)和N—H面內(nèi)變形振動(dòng)共同造成的；酰氨III帶（1 240～1 230 cm-1）的吸收強(qiáng)度最弱，主要源于C—N伸縮振動(dòng)和N—H面內(nèi)變形振動(dòng)[28]。這3 個(gè)酰氨吸收帶對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的敏感程度依次遞減。血清白蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要依賴于肽鏈中的C＝O和酰氨上N—H之間形成的氫鍵，且酰氨I帶對(duì)其結(jié)構(gòu)變化最靈敏，因此，酰胺I帶常被作為衡量血清白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的標(biāo)尺。由圖8可知，與游離的FBS相比，加入C3G后酰氨I帶峰位從1 653.32 cm-1移至1 652.12 cm-1，表明C3G可能結(jié)合到FBS亞域的C＝O基團(tuán)上，使多肽鏈氫鍵發(fā)生了重排，最終引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

圖 8 FBS的傅里葉變換紅外光譜Fig. 8 FTIR spectra of fetal bovine serum

圓二色光譜是檢測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的一種非常靈敏的方法。圓二色光譜一般可分為遠(yuǎn)紫外區(qū)光譜（178～250 nm）和近紫外區(qū)光譜（250～320 nm）。不同蛋白質(zhì)具有不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其光學(xué)活性對(duì)左右圓偏振光的吸收不同，因此，產(chǎn)生譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同，利用此性質(zhì)可對(duì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析[29]。由表5可知，C3G會(huì)使FBS中蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量減少，而β-折疊相對(duì)含量增加，這可能是α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)部分變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)，表明C3G與FBS的相互作用會(huì)降低FBS中α-螺旋相對(duì)含量，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加疏松，與張冬[30]的研究結(jié)果一致?？偟貋?lái)說(shuō)，C3G會(huì)減少FBS的α-螺旋相對(duì)含量，使其肽鏈?zhǔn)鎻?，從而改變其二?jí)結(jié)構(gòu)。

表 5 FBS的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 5 CD spectroscopic analysis of secondary structures in fetal bovine serum

2.7 FBS對(duì)C3G抗氧化活性的影響

圖 9 C3G的抗氧化活性Fig. 9 Antioxidant activity of C3G

由圖9可知，F(xiàn)BS會(huì)使C3G的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率顯著降低（P＜0.05），而FBS對(duì)DPPH自由基清除率和FRAP結(jié)果均無(wú)顯著性影響，表明其與C3G的相互作用會(huì)屏蔽其ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。Kanakis等[31]研究發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白與茶多酚形成的復(fù)合物能降低溶液中羥基的數(shù)目，影響茶多酚的供電子能力和抗氧化活性。周瑞等[32]研究也發(fā)現(xiàn)花青素與牛血清白蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，花青素中的羥基參與了氫鍵的形成，從而屏蔽了花青素的羥基，降低了其清除自由基的能力。說(shuō)明C3G和FBS的相互作用會(huì)影響其羥基的數(shù)目和功能，從而影響抗氧化活性。

3 結(jié) 論

細(xì)胞培養(yǎng)條件下，C3G在含10% FBS的RPMI培養(yǎng)基中比在RPMI培養(yǎng)基中更穩(wěn)定，其降解產(chǎn)物都為PCA和PGA，且在這兩種溶液中的降解動(dòng)力學(xué)模型都為零級(jí)動(dòng)力學(xué)。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C3G會(huì)使FBS的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅，且具有濃度依賴性，證實(shí)了這兩者之間存在相互作用，且該相互作用增強(qiáng)了C3G的穩(wěn)定性。兩者的作用機(jī)理為靜態(tài)猝滅，作用力類型主要為疏水作用力。C3G和FBS的相互作用對(duì)色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境構(gòu)象的影響不大，但是會(huì)降低α-螺旋的相對(duì)含量，增加β-折疊的相對(duì)含量，從而改變FBS中蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其肽鏈?zhǔn)鎻?，結(jié)構(gòu)變松散。而FBS對(duì)C3G的DPPH自由基清除能力和FRAP沒(méi)有明顯影響，但會(huì)顯著降低其ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。