楊飛艷，辜雪冬，孫術(shù)國(guó),，羅 章，謝司偉，黃文陽(yáng)

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

豬肉約占全球肉類消費(fèi)總量的40%[1]。藏香豬，在西藏又稱人參豬，生長(zhǎng)在海拔3 000～4 000 m的地區(qū)，以天然野生食用植物為主要食物，并以皮薄、脂肪含量低、肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而聞名[2-3]。然而，由于目前對(duì)藏香豬肉理化評(píng)價(jià)、加工技術(shù)等基礎(chǔ)研究缺乏，造成藏香豬肉在貯藏加工過(guò)程其質(zhì)構(gòu)、色澤、感官等品質(zhì)損失巨大。

肉的冰溫保鮮技術(shù)是最近20 年開(kāi)發(fā)的最新保鮮技術(shù)，相對(duì)于冷凍保鮮，其滴水損失少，貯藏過(guò)程品質(zhì)保持最佳，相對(duì)于冷藏保鮮技術(shù)，其保鮮時(shí)間更長(zhǎng)[4]。然而，目前研究肉的貯藏品質(zhì)主要通過(guò)測(cè)定質(zhì)地、外觀、風(fēng)味、顏色等[5]，主要集中于宏觀層面，較難解釋肉在貯藏過(guò)程品質(zhì)劣化分子機(jī)制。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在肉類科學(xué)中的應(yīng)用，為揭示肉在貯藏過(guò)程品質(zhì)變化規(guī)律提供重要研究手段，目前已有研究發(fā)現(xiàn)肉在冷藏過(guò)程中涉及與其品質(zhì)劣化相關(guān)的生物標(biāo)記物[6]，部分揭示了肉在貯藏過(guò)程中品質(zhì)劣化內(nèi)在分子機(jī)制[7]。冰溫保鮮相對(duì)冷藏保鮮優(yōu)勢(shì)明顯，但相關(guān)的保鮮分子機(jī)制原理仍不明確。

因此，本研究利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較分析了冰溫和冷藏保鮮條件下藏香豬冷鮮肉蛋白質(zhì)組的變化，旨在了解冰溫條件對(duì)藏香豬冷鮮肉品質(zhì)保鮮分子機(jī)制，為冰溫保鮮技術(shù)合理利用、冷鮮肉合理貯藏提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉選自西藏貢博甘達(dá)縣薩沙鎮(zhèn)的天然牧場(chǎng)藏香豬肉大腿肉（成年豬肉，正常、健康、無(wú)病、年齡1 歲）。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（質(zhì)量濃度為5 μg/μL）、氨水、胰酶美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶、肌鈣蛋白I（Troponin I）、鈣蛋白酶抑制素（Calpastatin）、反貝克林1（anti-Beclin 1）美國(guó)Promega公司；Bradford染液、甲醇、裂解液L3、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙酮廣州輝駿生物科技有限公司；乙腈美國(guó)Fisher公司；BCA蛋白分析試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1524R低溫培養(yǎng)箱珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；OQ610 Squirrel數(shù)據(jù)記錄器英國(guó)格蘭特儀器公司；SP-765PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；Nicolet iG50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀、Ultimate 3000 RSLC nano液相色譜（liquid chromatography，LC）儀、Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質(zhì)譜（mass chromatography，MS）儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Acclaim PepMap RSLC C18分析柱（2 mm×150 mm，2 μm）美國(guó)Dionex公司；XHF-DY均質(zhì)機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；DHP-9012恒溫箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將現(xiàn)宰的豬肉精細(xì)分割，取25 g冷鮮肉樣品進(jìn)行無(wú)菌袋包裝，放入含冰袋的保溫箱中，在3 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。所有無(wú)菌袋包裝的樣品置于低溫培養(yǎng)箱中，分別在－2 ℃和4 ℃中貯藏16 d，于第0、4、8、16天觀察并測(cè)定各項(xiàng)理化指標(biāo)。選取0 d與16 d的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.3.2 藏香豬冷鮮肉的冰點(diǎn)測(cè)定

用于測(cè)定實(shí)驗(yàn)的腔室溫度設(shè)置為（-20.0±1.0）℃。使用數(shù)據(jù)記錄器以1 min的間隔記錄溫度。當(dāng)所有探針記錄的溫度均低于-10 ℃時(shí)，將樣品從培養(yǎng)箱中取出。藏香豬冷鮮肉的冰點(diǎn)是根據(jù)冰點(diǎn)曲線的“高原”初始溫度確定的，平衡冰點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)冷卻速度最慢時(shí)的溫度范圍[8]。

1.3.3 總揮發(fā)性鹽基氮含量的測(cè)定

根據(jù)GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》測(cè)定總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量。

1.3.4 彈性感官評(píng)分的測(cè)定

參考GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》對(duì)肉彈性進(jìn)行打分。肉彈性指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：1）按壓肉樣表面后立即恢復(fù)評(píng)分為10 分；2）按壓肉樣表面恢復(fù)較快評(píng)分為8 分；3）按壓肉樣后凹陷恢復(fù)緩慢評(píng)分為6 分；4）按壓肉樣后凹陷不能恢復(fù)評(píng)分為小于4 分；若樣品平均分小于6 分，則視為感官不可接受[9]。

1.3.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

利用FTIR分析總蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[10]。將真空冷凍干燥48 h后的藏豬肉粉碎成200 目的粉末，準(zhǔn)確稱量2 mg樣品，加入0.1 g干燥無(wú)水的溴化鉀，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片進(jìn)行FTIR分析，數(shù)據(jù)采集范圍在4 000～500 cm-1，每次測(cè)定前需扣除空氣背景光譜，32 次掃描積累，分辨率為4 cm-1，每個(gè)樣品測(cè)定3 次，取最具代表性的圖譜用于分析。

1.3.6 菌落總數(shù)測(cè)定

菌落總數(shù)（total aerobic count，TAC）的測(cè)定按照參考Liu Qian等[11]的方法。無(wú)菌條件下每個(gè)處理組稱10 g碎豬肉，用90 mL 0.85 g/100 mL無(wú)菌生理鹽水勻漿1 min。將1 mL勻漿液加入9 mL 0.85 g/100 mL無(wú)菌生理鹽水中，連續(xù)稀釋10 倍。在（36±1）℃下孵育48 h，菌落總數(shù)以lg（CFU/g）表示。

1.3.7 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.3.7.1 蛋白質(zhì)提取、胰蛋白酶消化及iTRAQ試劑標(biāo)記

取豬肉（3 g）與1 mL L3裂解液，預(yù)冷卻、砂漿完全研磨溶解后，轉(zhuǎn)移至環(huán)氧樹(shù)脂試管（1.5 mL）中，超聲處理（功率600 W、間隔1.5 s）5 min，于12 000 r/min、4 ℃離心20 min，并收集上清液。取上清液于4 個(gè)試管中，每個(gè)試管取250 μL，并在-20 ℃下加入1 mL丙酮過(guò)夜使其沉淀。將沉淀的蛋白質(zhì)在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，倒出上清液，干燥，得到加工的蛋白質(zhì)塊。加入適量的裂解液L3以溶解蛋白質(zhì)，超聲溶解（100 W，打開(kāi)0.8 s、關(guān)閉0.8 s，超聲4 次，重復(fù)溶解一次），在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸出上清液并轉(zhuǎn)移到新的EP管中。用0.22 μm聚偏氟乙烯膜過(guò)濾，獲得豬肉總蛋白提取物，用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定濾液的蛋白質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化及iTRAQ試劑標(biāo)記參考Mi Si等[12]的方法。

1.3.7.2 高pH值反相色譜分級(jí)

先用100 μL體積分?jǐn)?shù)95%的A相（20 mmol/L甲酸銨，pH 10.0）和100 μL體積分?jǐn)?shù)5%的B相（含20 mmol/L甲酸銨，pH 10.0）平衡柱子30 min，然后將標(biāo)記后的混合多肽用100 μL的A相復(fù)溶；進(jìn)樣，以0.2 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫；梯度洗脫條件為：0～5 min，5% B；5～10 min，5%～10% B；10～60 min，10%～40% B；60～65 min，4 0%～9 5% B；6 5 ～7 5 m i n，保持95% B；75 min～85 min，95%～5% B。整個(gè)洗脫過(guò)程在214 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從梯度洗脫開(kāi)始根據(jù)峰型收集組分，每管接60 s，反復(fù)循環(huán)接樣；根據(jù)峰型和時(shí)間共收取10 個(gè)組分，真空干燥后，進(jìn)行第二維反向LC-MS分析。

1.3.7.3 第二維反相LC-MS分析

LC條件：色譜柱為Acclaim PepMap RSLC C18柱，流動(dòng)相A為1%（體積分?jǐn)?shù)，后同）的甲酸溶液，流動(dòng)相B為80%的乙腈溶液（含0.1%甲酸）。洗脫條件為：0～5 min，5% B；5～8 min，5%～10% B；8～40 min，10%～30% B；40～45 min，30%～35% B；45～50 min，35%～90% B；50～55 min，保持90% B；55～56 min，90%～5% B；56～65 min，5% B；流速為300 nL/min。

MS條件：一級(jí)MS參數(shù)：分辨率60 k，最大離子強(qiáng)度400 000，最大注入時(shí)間50 ms，掃描范圍：350～1 800m/z；二級(jí)MS參數(shù)：分辨率7.5 k；最大離子強(qiáng)度50 000；最長(zhǎng)注入時(shí)間80 ms；母離子選擇20 個(gè)；母離子碎裂方法為高能碰撞解離；碰撞能量32%。

1.3.7.4 蛋白質(zhì)鑒定和定量

使用Penrot Pilot Software 4.5軟件對(duì)MS鑒定結(jié)果進(jìn)行合并和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，通過(guò)添加反庫(kù)計(jì)算由隨機(jī)匹配導(dǎo)致的誤報(bào)率（false positive rate，F(xiàn)DR）。FDR設(shè)置為小于1%，并且至少有一種匹配的特異性肽。搜索參數(shù)包括：樣品類型＝iTRAQ 8plex（標(biāo)記肽）；半胱氨酸烷基化＝碘乙酰胺；酶＝胰蛋白酶。蛋白質(zhì)閾值大于1.3（相當(dāng)于≥95%的肽置信度）用作鑒定標(biāo)準(zhǔn)。利用Excel軟件對(duì)蛋白可信肽段數(shù)和覆蓋率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用Prism Graph軟件作圖。采用t檢驗(yàn)對(duì)兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行相對(duì)定量分析，以1.5 倍臨界值評(píng)估蛋白表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)，P＜0.05表示差異顯著。

1.3.7.5 差異表達(dá)蛋白分析

采用單變量分析差異倍數(shù)和t統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)進(jìn)行BH校正得到P值。差異離子同時(shí)滿足：差異倍數(shù)平均值（average，AVG）不低于2.0（或AVG不高于0.5）、P＜0.05的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是差異表達(dá)蛋白。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡分析

使用12%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的SDS-十二烷基硫酸鈉分離蛋白質(zhì)樣品（20 μg），然后將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后，在室溫下用搖床將膜用5%脫脂奶（含0.5% Tris-HCl+0.05% Tween，TBS/T）封閉1 h。按1∶5 000的比例加入一抗（anti-Beclin 1），即6 mL含5% BSA的TBS/T加入1.5 μL抗體，過(guò)夜。然后，將膜用TBS/T洗滌3 次（每次10 min）。在室溫下用5% BSA以1∶3 000比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h后，將膜在TBS/T中洗滌3 次（每次10 min）。最后，將膜的蛋白質(zhì)面朝上放置在兩層膠片之間，將這兩層膠片或其他透明膠片粘貼在曝光盒上。利用ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒進(jìn)行曝光、顯影和定影。

1.4 生物信息學(xué)與統(tǒng)計(jì)分析

為了表征豐度差異蛋白的特性。使用基因本體（gene ontology，GO）（http://www.geneontology.org）進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能注釋。利用京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途徑數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）預(yù)測(cè)所鑒定蛋白質(zhì)的主要代謝途徑和生化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。對(duì)于豬肉樣品品質(zhì)的參數(shù)結(jié)果，使用SPSS 18.0軟件的多因素方差分析進(jìn)行多重比較，所有結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，所有豬肉樣品使用6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3 次平行。使用SPSS 18.0軟件對(duì)豬肉中的豐度差異蛋白與品質(zhì)指標(biāo)之間進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏香豬冷鮮肉的冰點(diǎn)溫度

圖 1 藏香豬冷鮮肉的冷凍曲線Fig. 1 Freezing curve of chilled Tibetan fragrant pig meat

如圖1所示，當(dāng)溫度下降到-2.3～-2.5 ℃時(shí)，進(jìn)入最大冰晶形成區(qū)，溫度下降極慢，由此測(cè)定藏香豬冷鮮肉的冰點(diǎn)為-2.4～-2.5 ℃，低于普通豬肉的冰點(diǎn)（-0.8～-1.2 ℃）[13]，主要是這兩種豬肉在組成成分的差異所導(dǎo)致，如藏香豬肉氨基酸、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和微量元素相對(duì)普通豬肉含量更高[14]，高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能導(dǎo)致藏香豬更低的冰點(diǎn)，然而，富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)理論上是不利于其貯藏保鮮，冷藏和冰溫的表現(xiàn)效果是否存在差異，目前鮮有相關(guān)的報(bào)道。同時(shí)，藏香豬肉較低的冰點(diǎn)溫度特點(diǎn)有利于將過(guò)冷技術(shù)應(yīng)用到藏香豬冷鮮肉的貯存和保藏中，因?yàn)樗峁┝烁鼘挼墓ぷ鳒囟确秶?，并降低了?duì)保藏設(shè)備的要求[15]。

2.2 冰溫保鮮條件下藏香豬冷鮮肉理化指標(biāo)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

TVB-N是指蛋白質(zhì)在酶和細(xì)菌的作用下分解，產(chǎn)生揮發(fā)性的堿性含氮物質(zhì)，例如氨、伯胺和仲胺等，其含量是評(píng)估肉類新鮮度的重要指標(biāo)。藏香豬肉冷藏16 d，其TVB-N含量從5.10 mg/100 g（初始值）升高到17.77 mg/100 g，已經(jīng)超過(guò)新鮮肉的限量值（15 mg/100 g）[16-17]，而冰溫貯藏的藏香豬肉樣品TVB-N含量從初始值增加到13.51 mg/100 g，結(jié)果表明冰溫貯藏對(duì)藏香豬冷鮮肉保鮮效果更好（表1），表1中藏香豬冷鮮肉在冰溫貯藏和冷藏過(guò)程中TAC變化與TVB-N含量變化結(jié)果一致?？赡軞w因于冰溫相對(duì)于冷藏，冷鮮肉內(nèi)源酶和腐敗細(xì)菌引發(fā)的蛋白質(zhì)降解反應(yīng)速率更低，包括核苷酸降解、游離氨基酸的脫氨基、脫羧以及胺類的氧化等反應(yīng)速率[18]，藏香豬冷鮮肉蛋白質(zhì)降解會(huì)導(dǎo)致其質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味品質(zhì)劣化。感官指標(biāo)是衡量冷鮮肉品質(zhì)的一種最直接、重要的指標(biāo)，能夠影響消費(fèi)者的購(gòu)買意向[19]。藏香豬冷鮮肉彈性隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，但冷藏條件下降更快。豬肉蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定了其功能特性，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與肉的整體品質(zhì)密切相關(guān)[20]。酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)域，吸收峰最強(qiáng)，經(jīng)常被用于分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[21]。本研究結(jié)果表明在冰溫和冷藏16 d條件下，藏香豬肉樣中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要表現(xiàn)為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角變化，而α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量雖然也變化，但變化不顯著（數(shù)據(jù)未展示），冰溫貯藏過(guò)程中藏香豬冷鮮肉蛋白質(zhì)β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量變化不顯著（P＞0.05），冷藏過(guò)程中β-折疊相對(duì)含量變化顯著，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量變化雖然不顯著，但比冰溫貯藏組變化大，說(shuō)明藏香豬肉在冰溫貯藏條件下蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)較冷藏條件更穩(wěn)定，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞的程度較低，對(duì)冷鮮肉質(zhì)地結(jié)構(gòu)起到較好的保護(hù)作用[22]。

表 1 藏香豬冷鮮肉在不同貯藏溫度下的TAC、理化品質(zhì)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Table 1 Changes in TAC, physicochemical quality and protein secondary structure contents in chilled Tibetan fragrant pig meat stored at different temperatures

2.3 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果

對(duì)采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后，總共匹配了4 756 個(gè)蛋白質(zhì)，并將它們映射到1 197 個(gè)可信賴的蛋白質(zhì)上。在所有鑒定出的蛋白質(zhì)中，約71.7%的蛋白質(zhì)包含至少兩個(gè)肽（圖2A）。此外，鑒定出的蛋白質(zhì)具有較高的序列覆蓋率，鑒定出67.57%的蛋白質(zhì)具有超過(guò)5%的序列覆蓋率，鑒定出43.48%的蛋白質(zhì)具有超過(guò)10%的序列覆蓋率（圖2B）。肽段長(zhǎng)度顯示大多數(shù)肽段長(zhǎng)度在6～17范圍內(nèi)（圖2C）；肽段長(zhǎng)度超過(guò)11后，隨著肽段長(zhǎng)度的增加，肽段的數(shù)量變得越來(lái)越少。

圖 2 藏香豬冷鮮肉定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果Fig. 2 Results of quantitative proteomics analysis of chilled Tibetan fragrant pig meat

2.4 豐度差異蛋白的鑒定和比較結(jié)果

基于“AVG≥2.0或AVG≤0.5，且P＜0.05”的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)鑒定了豐度差異蛋白。與0 d肉樣品相比，在-2 ℃和4 ℃下16 d的肉樣品中共有179 個(gè)蛋白質(zhì)豐度發(fā)生了顯著變化。-2 ℃16 d/0 d和4 ℃16 d/0 d比較分別有143 個(gè)豐度差異蛋白和97 個(gè)豐度差異蛋白，包括61 個(gè)共有的豐度差異蛋白（圖3A）。考慮到豬肉蛋白質(zhì)組在兩種溫度條件下變化的復(fù)雜性，本研究擬從其重疊的61 種豐度差異蛋白變化規(guī)律中尋找溫度對(duì)豬肉品質(zhì)影響的共同規(guī)律和分子機(jī)制。

2.5 重疊豐度差異蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

GO分析結(jié)果如圖3B和圖3C所示。在生物過(guò)程中，重疊豐度差異蛋白質(zhì)主要參與解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生物合成過(guò)程和細(xì)胞分化；在分子功能分類中，重疊豐度差異蛋白質(zhì)主要功能涉及離子結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合以及結(jié)構(gòu)分子活性等；在細(xì)胞組成中，重疊豐度差異蛋白質(zhì)主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架以及含蛋白質(zhì)復(fù)合物中。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果如圖3D和圖3E所示，結(jié)果表明，重疊豐度差異蛋白質(zhì)主要涉及代謝通路、肌肉擴(kuò)張障礙、鈣信號(hào)通路等途徑。根據(jù)結(jié)果可以推測(cè)，冷鮮肉在貯藏過(guò)程，其細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞骨架中與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白分子功能發(fā)生變化，導(dǎo)致它們參與的代謝、結(jié)構(gòu)功能以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能發(fā)生障礙，而蛋白質(zhì)和代謝酶作為豬肉組織中重要組成部分，其結(jié)構(gòu)、分子功能和分布的變化必然會(huì)影響到肉的色澤、質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)，譬如肌紅蛋白結(jié)構(gòu)變化就會(huì)影響肉的色澤變化和質(zhì)構(gòu)變化。而這種變化非常容易受到貯藏溫度和微生物的影響，因此，通過(guò)對(duì)貯藏豬肉重疊豐度差異蛋白的生物信息學(xué)分析，宏觀掌握貯藏豬肉品質(zhì)變化過(guò)程中所涉及的生物過(guò)程、分子功能和相關(guān)蛋白的分布，進(jìn)而推測(cè)肉品質(zhì)變化的可能分子機(jī)制以及受到的影響原因。

圖 3 藏香豬冷鮮肉在－2 ℃和4 ℃條件下貯藏16 d后與0 d相比的蛋白差異表達(dá)Fig. 3 Analysis of differentially expressed proteins in chilled Tibetan fragrant pig meat stored at －2 and 4 ℃ for 16 days

2.6 藏香豬冷鮮肉中豐度差異蛋白與微生物指標(biāo)、理化品質(zhì)及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)性

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用肉類研究成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，Yu Qianqian等[23]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究牛宰后肉品質(zhì)變化規(guī)律，基于蛋白質(zhì)分子水平一定程度解釋了牛肉成熟機(jī)制。然而，動(dòng)物宰后成熟階段與其冷鮮肉貯藏過(guò)程是兩個(gè)完全不同過(guò)程，貯藏肉的質(zhì)構(gòu)、貯藏環(huán)境條件以及表面微生物數(shù)量與成熟階段肉存在巨大差異；因而，動(dòng)物宰后成熟階段蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果并不能用于解釋冷鮮肉在貯藏過(guò)程的品質(zhì)變化機(jī)制。藏香豬肉與普通豬肉的組成差異明顯，而其他品種豬肉的蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果參考性非常有限，因此，基于蛋白組學(xué)技術(shù)研究藏香豬肉在冰溫和冷藏貯藏過(guò)程中品質(zhì)變化機(jī)制，可以補(bǔ)充相關(guān)研究的不足。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)，利用Pearson相關(guān)性分析法對(duì)重疊豐度差異蛋白與冷鮮肉的微生物指標(biāo)、品質(zhì)特性（TVB-N含量和彈性）和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（β-折疊相對(duì)含量和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量）進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），旨在初步探明藏香豬肉冰溫保鮮的分子機(jī)制。結(jié)果表明：這些豐度差異蛋白根據(jù)特定功能分為5 類：結(jié)構(gòu)蛋白（39.3%）、代謝酶（11.5%），應(yīng)激蛋白（8.2%），鈣調(diào)節(jié)蛋白（16.4%）和其他蛋白（24.6%），其與冷鮮肉的微生物指標(biāo)、品質(zhì)特性（TVB-N含量和彈性）和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量）整體上存在顯著相關(guān)性。

表 2 藏香豬冷鮮肉中豐度差異蛋白表達(dá)量與TAC、品質(zhì)（TVB-N含量和彈性）、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量）的相關(guān)性Table 2 Correlation of differentially expressed proteins in chilled Tibetan fragrant pig meat with TAC, quality traits (TVB-N content and springiness)and protein secondary structure (β-sheet and β-turn contents)

2.6.1 結(jié)構(gòu)蛋白

結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)豬肉組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)構(gòu)以及色澤起著重要的作用。肌球蛋白在調(diào)節(jié)收縮、細(xì)胞內(nèi)囊泡遞送、細(xì)胞遷移、胞質(zhì)分裂和維持細(xì)胞形態(tài)中起重要作用[23]。研究結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)蛋白中肌球蛋白-1、慢型-肌球蛋白結(jié)合蛋白C、肌球蛋白-4、肌球蛋白-2、原肌球蛋白α-1鏈和原肌球蛋白α-3鏈表達(dá)量均與肉的彈性和β-折疊相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與TVB-N含量、TAC和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量呈顯著（P＜0.05）或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）（表2）。這說(shuō)明豬肉貯藏過(guò)程中其肌球蛋白經(jīng)歷降解，蛋白質(zhì)β-折疊相對(duì)含量降低，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量增加，肉的彈性降低，導(dǎo)致肉的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變差，而這種質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變化主要受到貯藏溫度和冷鮮肉TAC的影響。從上述結(jié)構(gòu)蛋白在冰溫（-2 ℃）和冷藏（4 ℃）兩種溫度條件下差異表達(dá)情況可知，冰溫更利于結(jié)構(gòu)蛋白的保持，可能原因在于冰溫更利于控制腐敗微生物對(duì)蛋白質(zhì)的降解，本研究藏香豬冷鮮肉在貯藏過(guò)程結(jié)構(gòu)蛋白變化規(guī)律一定程度解釋了其品質(zhì)變化規(guī)律。Shi Jing等[24]研究也表明，肉肌球蛋白在肉貯藏過(guò)程降解越快，其質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味以及色澤等品質(zhì)下降越快。

2.6.2 代謝酶

本研究分析了α-1,4-葡聚糖磷酸化酶、4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、AMP脫氨酶、磷酸甘油酸突變酶、UTP-1-磷酸葡萄糖尿酰轉(zhuǎn)移酶等代謝酶與藏香豬冷鮮肉的品質(zhì)特征的相關(guān)性，結(jié)果表明，α-1,4-葡聚糖磷酸化酶和4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量均與TVB-N含量、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)，與肉彈性指標(biāo)和β-折疊呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05）（表2），α-1,4-葡聚糖磷酸化酶促進(jìn)肉糖原分解，4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶將分解的糖基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上，且在冰溫條件下這兩種代謝酶的表達(dá)量顯著高于冷藏條件，說(shuō)明冰溫貯藏能為冷鮮肉正常生理代謝提供必要的能量，抑制蛋白質(zhì)分解生成胺基，冰溫條件能較好地保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，維持冷鮮肉的彈性指標(biāo)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。AMP脫氨酶表達(dá)量與TVB-N含量、TAC呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與冷鮮肉其他品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性較低，且在冷藏條件下其表達(dá)量高于冰溫條件，說(shuō)明冰溫條件抑制腺苷一磷酸被AMP脫氨酶催化降解成NH3和肌苷酸[25]，有利于冷鮮肉貯藏保鮮。磷酸甘油酸突變酶表達(dá)量與TVB-N含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與TAC呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與冷鮮肉其他品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性較低，且在冰溫條件下其表達(dá)量高于冷藏條件，說(shuō)明冰溫條件更好地維持冷鮮肉碳代謝，有利于冷鮮肉貯藏保鮮。

2.6.3 應(yīng)激蛋白

應(yīng)激蛋白又稱為熱休克蛋白，是在高熱、缺血、缺氧和其他應(yīng)激條件下由變性蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的，其表達(dá)量能反映細(xì)胞受到外界的刺激水平[26-27]。熱休克蛋白beta-7和熱休克蛋白家族B（?。┏蓡T6這兩種熱休克蛋白的表達(dá)量與TVB-N含量、TAC呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與β-轉(zhuǎn)角含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與肉彈性和β-折疊相對(duì)含量呈現(xiàn)顯著（P＜0.0 5）或極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)（表2），且在冰溫條件下其表達(dá)量低于冷藏條件，說(shuō)明冰溫條件對(duì)藏香豬冷鮮肉細(xì)胞刺激水平更低，受到微生物污染更輕，能夠減少蛋白質(zhì)變性酶解，從而維持冷鮮肉的彈性指標(biāo)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，達(dá)到貯藏保鮮的效果。

2.6.4 鈣調(diào)節(jié)蛋白

肌鈣蛋白是肌肉組織收縮的調(diào)節(jié)蛋白，位于收縮蛋白的細(xì)肌絲上，在肌肉收縮和舒張過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，Bekhit等[28]發(fā)現(xiàn)鮮綿羊肉于5～35 ℃真空貯藏過(guò)程中，其肌肉中的肌鈣蛋白（肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白C）表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明肌肉細(xì)胞受到損傷，表明蛋白一定程度發(fā)生降解。肌鈣蛋白T和結(jié)構(gòu)蛋白等細(xì)胞骨架蛋白與肉質(zhì)性狀息息相關(guān)，已知存在于骨骼肌中[29]。本研究結(jié)果表明，肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C表達(dá)量均與TVB-N含量和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與肉彈性和β-折疊相對(duì)含量呈現(xiàn)顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）正相關(guān)，且在冰溫條件下其表達(dá)量低于冷藏條件，說(shuō)明藏香豬冷鮮肉細(xì)胞在冰溫條件下受到損傷少，肌肉彈性和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)仍然保持較好。鈣蛋白酶抑制蛋白是一種廣泛分布的內(nèi)源性抑制蛋白質(zhì)，能特異地抑制需鈣激活的中性蛋白酶，其分子結(jié)構(gòu)中每個(gè)鈣抑素分子均包含1 個(gè)前導(dǎo)（L）域和4 個(gè)抑制域（I～I(xiàn)V），每個(gè)抑制域均可以抑制1 個(gè)鈣蛋白酶分子表達(dá)[30-31]。鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量與TVB-N含量和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與肉彈性和β-折疊相對(duì)含量呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）正相關(guān)，且在冷藏條件下該蛋白表達(dá)量為冰溫條件下的2.33 倍，說(shuō)明冷藏條件下發(fā)生更為劇烈的蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)，冷鮮肉由于自身存在免疫系統(tǒng)，會(huì)誘導(dǎo)鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量上調(diào)。上述結(jié)果一定程度上反映藏香豬冷鮮肉在冰溫條件下蛋白質(zhì)分解速率更慢，有利于抑制腐敗微生物增殖和蛋白分解產(chǎn)生胺基，較好地保持肉彈性和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，起到較好的貯藏保鮮效果。

2.6.5 其他蛋白

在其他蛋白中，半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白3在細(xì)胞胞漿結(jié)構(gòu)組織中起著關(guān)鍵的作用，其表達(dá)量與TVB-N含量、TAC和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與肉彈性和β-折疊相對(duì)含量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）（表2），且冰溫條件表達(dá)量遠(yuǎn)低于冷藏條件，一定程度說(shuō)明冷藏條件冷鮮肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化更大，盡管冰溫和冷藏條件下細(xì)胞自身存在免疫系統(tǒng)，但冷藏條件其受到更多逆環(huán)境（相對(duì)較高溫度、微生物等）作用，可能會(huì)導(dǎo)致半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白3表達(dá)量更高。

2.7 蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證結(jié)果

圖 4 冷鮮豬肉在貯藏期間Western Blot分析（A）及不同貯藏溫度條件下Troponin I（B）和Calpastatin（C）差異表達(dá)Fig. 4 Western blot analysis (A) of troponin I and calpastatin in chilled fragrant pig meat during storage and their differential expression levels (B, C) at different storage temperatures

為了驗(yàn)證研究中iTRAQ觀察結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇了具有代表性的兩種重疊差異蛋白質(zhì)（Troponin I和Calpastatin）進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。如圖4所示，Western Blot印跡分析結(jié)果表明，與0 d相比，藏香豬冷鮮肉中Troponin I和Calpastatin在16 d時(shí)的相對(duì)表達(dá)量明顯增加，但冷鮮肉在冷藏條件下這兩種蛋白相對(duì)表達(dá)量更高，這與表2分析結(jié)果高度一致，一定程度上反映本蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法可靠性較高，同時(shí)也說(shuō)明貯藏溫度顯著影響冷鮮肉蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而造成肉品質(zhì)的差異。

3 結(jié) 論

藏香豬冷鮮肉的冰點(diǎn)溫度為-2.4～-2.5 ℃。貯藏過(guò)程中，冰溫條件豬肉TAC、TVB-N含量、彈性及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化明顯低于冷藏條件，與0 d肉樣品相比，在兩種貯藏條件下共有179 個(gè)蛋白質(zhì)豐度發(fā)生了顯著變化，其中共有豐度差異蛋白61 個(gè)，這些蛋白質(zhì)主要分為結(jié)構(gòu)蛋白、代謝酶、應(yīng)激蛋白和鈣調(diào)節(jié)蛋白，這些共有豐度差異蛋白與豬肉理化品質(zhì)及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)之間正體上具有顯著相關(guān)性，可以作為潛在生物標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記豬肉貯藏品質(zhì)優(yōu)劣。初步推測(cè)冰溫保鮮機(jī)制在于，相對(duì)于冷蔵保鮮，冰溫保鮮更好抑制冷鮮肉微生物增長(zhǎng)，降低了豬肉蛋白質(zhì)（如Troponin I和Calpastatin）表達(dá)量，特別是能降低腐敗微生物對(duì)肉蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，從而較好保持豬肉理化和質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。本研究從蛋白質(zhì)分子水平初步解釋了冰溫貯藏保鮮的分子機(jī)制，研究成果可為合理設(shè)計(jì)冷鮮肉貯藏條件提供參考。