王曉杰，曲 悅，劉曉蘭，馬 瑞

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

玉米醇溶蛋白以聚集體形式存在于玉米胚乳細(xì)胞內(nèi)，分布于粒徑為5～35 μm的淀粉粒之間[1]。玉米醇溶蛋白富含谷氨酸（21%～26%）、亮氨酸（20%）、脯氨酸（10%）和丙氨酸（10%），但缺乏堿性和酸性氨基酸，尤其是色氨酸與賴氨酸[2]。玉米醇溶蛋白的氨基酸組成特點決定其具有獨特的溶解性：不溶于水，在堿性溶液（pH≥11）和體積分?jǐn)?shù)為60%～95%的醇類溶液中溶解度較高[3]。在我國，玉米醇溶蛋白作為濕磨法玉米淀粉生產(chǎn)的下腳料，大部分作為飼料原料出售，經(jīng)濟(jì)效益較低。因此，需要依據(jù)不同的技術(shù)不斷開發(fā)這種蛋白質(zhì)原料的新用途，以增加玉米深加工企業(yè)的附加值。

玉米肽是玉米蛋白經(jīng)蛋白酶水解或微生物發(fā)酵后獲得的低分子質(zhì)量產(chǎn)物。與玉米蛋白相比，玉米肽的溶解性顯著增加，而且具有高濃度、低黏性、酸性環(huán)境下不易沉淀、容易吸收和食用安全等特點[4]。另外，玉米蛋白富含疏水性氨基酸的獨特特點賦予玉米肽多重生物活性，包括抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性[5]、抗氧化[6]、護(hù)肝[7]、降血糖[8]等，這些活性主要受酶特異性和水解條件（pH值、溫度、酶與底物之比和水解度）的控制。基于玉米肽的上述健康功能，其在食品、醫(yī)藥、保健食品等領(lǐng)域顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外市場上已經(jīng)有兩大類玉米肽產(chǎn)品，一類是基于動物實驗和人體實驗的醒酒保肝功效[9-10]，將玉米肽作為主要原料生產(chǎn)醒酒護(hù)肝類飲品和片劑；一類是基于營養(yǎng)組成和功效互補(bǔ)的原則，將玉米肽作為輔助原料，與其他生物活性物質(zhì)復(fù)配生產(chǎn)功能性食品或特殊醫(yī)學(xué)配方食品[11]。但是，隨著研究工作的逐步深入，發(fā)現(xiàn)經(jīng)蛋白酶酶法水解制備玉米肽時，會因酶解過程中調(diào)節(jié)酸堿度引入的鹽分而帶來異味，而這種味道的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了玉米肽的風(fēng)味和理化性質(zhì)[12]，導(dǎo)致玉米生物活性肽成為高鹽食品而使其在食品工業(yè)的應(yīng)用受到限制。因此，為了滿足人們對健康食品的需求，需要從玉米肽中去除部分鹽分。目前，適合于生物活性物質(zhì)的脫鹽方法主要包括透析、超濾、納濾、電滲析、大孔樹脂法和離子交換樹脂法等[13]。其中，納濾膜對單價離子截留率低，又同時具有脫鹽和濃縮于一體的效果[14]，非常適用于因酶解過程而引入單價離子的生物活性肽的脫鹽處理。在采用納濾對不同來源生物活性肽進(jìn)行脫鹽時，脫鹽率一般在42.56%～95.90%范圍內(nèi)，短肽回收率在73.82%～98.49%范圍內(nèi)[14-18]。

本實驗以玉米抗氧化活性肽為原料，以膜通量、電導(dǎo)率、脫鹽率以及抗氧化活性為指標(biāo)，確定不影響玉米肽抗氧化活性的納濾脫鹽工藝，同時利用H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化性損傷模型對脫鹽玉米肽的抗氧化活性進(jìn)行了研究，為抗氧化活性玉米肽的工業(yè)化生產(chǎn)及其在食品工業(yè)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿性蛋白酶丹麥諾維信公司；鄰苯二甲醛、菲洛嗪、硫代巴比妥酸、噻唑藍(lán)（thiazole blue，MTT）上海生工生物有限公司；玉米醇溶蛋白、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2-脫氧-D-核糖美國Sigma公司；Caco-2細(xì)胞南京凱基生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基（高糖）、0.25%胰蛋白酶美國Gibico公司；胎牛血清德國PAN公司；RIPA高效裂解液北京索萊寶公司；總蛋白定量（BCA法）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）試劑盒、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcsteine synthetase，γ-GCS）試劑盒南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HYM-Multi-RN多功能實驗分離機(jī)廈門昊源膜科技有限公司；截留分子質(zhì)量150 Da納濾膜美國GE公司；NDA701凱氏定氮儀意大利VELP公司；DDSJ-308A電導(dǎo)率儀上海雷磁儀器廠；ICE3000原子吸收光譜儀美國賽默飛世爾科技有限公司；DU800紫外-可見分光光度計貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；NV 4750E二氧化碳培養(yǎng)箱美國NUAIRE公司；EnSpire多功能酶標(biāo)儀美國珀金埃爾默股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米肽的制備

玉米肽的制備方法參照文獻(xiàn)[19]。取40 g玉米醇溶蛋白于1 000 mL燒杯中，加入800 mL蒸餾水，攪拌均勻后將燒杯放入60 ℃水浴磁力攪拌器中央，調(diào)節(jié)pH值至8.5，加入1.2 g堿性蛋白酶開始酶解反應(yīng)，酶解過程中通過不斷滴加1 mol/L NaOH溶液使pH值維持在8.5，酶解2.0 h后取出放入沸水浴中滅酶15 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清液即獲得玉米肽。此時，玉米醇溶蛋白的水解度為（23.99±0.21）%（采用pH-stat法測定）；玉米肽的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（81.86±0.50）%（采用凱氏定氮法測定），85.47%玉米肽的分子質(zhì)量主要分布在300～6 500 Da范圍內(nèi)（采用凝膠層析法測定）。

1.3.2 玉米肽納濾脫鹽工藝的操作溫度和壓力的確定

取1.3.1節(jié)中制備的玉米肽，在一定溫度和一定壓力條件下，分別測定玉米肽通過截留分子質(zhì)量150 Da納濾膜的膜通量，以確定玉米肽納濾脫鹽工藝的操作溫度和壓力，膜通量具體按公式（1）計算。

式中：Vp為透過液的體積/L；t為操作時間（0.5 h）；A為膜有效面積（0.38 m2）。

1.3.3 玉米肽納濾脫鹽工藝

在1.3.2節(jié)部分確定的溫度和壓力條件下，將1.3.1節(jié)制備的玉米肽過截留分子質(zhì)量150 Da納濾膜進(jìn)行脫鹽處理。納濾原液體積記為V0，經(jīng)納濾膜脫鹽、濃縮至體積Vr（Vr＝1/2V0），體積濃縮倍數(shù)為2，并測定透過液和截留液的電導(dǎo)率，此為第1次納濾；向截留液中加入適量的蒸餾水至體積為V0，經(jīng)納濾膜脫鹽、濃縮至體積濃縮倍數(shù)為2，此為第2次納濾；如此重復(fù)納濾5 次，每次固定納濾頻率50 Hz。取每次納濾結(jié)束加完蒸餾水的截留液，進(jìn)行冷凍干燥，將干燥好的玉米肽用于測定蛋白質(zhì)含量、Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化活性。

1.3.4 電導(dǎo)率、Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)、脫鹽率、短肽回收率的測定

電導(dǎo)率的測定參照文獻(xiàn)[14]，單位為mS/cm；Na+質(zhì)量（mNa+）采用原子吸收光譜儀測定，采用公式（2）計算Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)；脫鹽率和短肽回收率分別按公式（3）、（4）計算；原液、透過液和截留液中蛋白質(zhì)量濃度采用福林-酚法測定[20]。

式中：ρ0、ρp和ρr分別為原液、透過液和截留液中的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/L）；m肽為玉米肽中的蛋白質(zhì)量/mg；V0、Vp和Vr分別為原液、透過液和截留液體積/L。

1.3.5 玉米肽抗氧化活性的測定

以未納濾的玉米肽作為對照，測定玉米肽質(zhì)量濃度為2 mg/mL（以蛋白質(zhì)量計）時其羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和亞鐵離子螯合能力，測定方法參照文獻(xiàn)[21]。

1.3.6 利用H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化性損傷模型研究脫鹽玉米肽的抗氧化活性

1.3.6.1 脫鹽玉米肽對Caco-2細(xì)胞毒性的測定

脫鹽玉米肽對Caco-2細(xì)胞毒性的測定采用MTT法，具體參照文獻(xiàn)[22]。Caco-2細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為添加10%（體積分?jǐn)?shù)，后同）胎牛血清和1%雙抗的DMEM（高糖）培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%～90%時，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。實驗選用20～30 代細(xì)胞。

1.3.6.2 H2O2氧化應(yīng)激條件下Caco-2細(xì)胞存活率的測定

將對數(shù)期Caco-2細(xì)胞以密度為1×105個/mL接種至96 孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，對照組和H2O2組每孔加入100 μL DEME培養(yǎng)基，樣品組每孔加入100 μL脫鹽玉米肽溶液（蛋白終質(zhì)量濃度分別為5、50、100、200、500 μg/mL和1 000 μg/mL），樣品作用Caco-2細(xì)胞6 h后吸棄孔內(nèi)液體，對照組每孔加入200 μL DEME培養(yǎng)基，H2O2組和樣品組每孔加入200 μL 200 μmol/L H2O2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，根據(jù)1.3.6.1節(jié)中的MTT法測定細(xì)胞存活率。

1.3.6.3 H2O2應(yīng)激條件下抗氧化酶活力的測定

將對數(shù)期Caco-2細(xì)胞以1.5×105個/mL接于6 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h后，對照組和H2O2組每孔加入200 μL DMEM培養(yǎng)基，樣品組每孔加入蛋白終質(zhì)量濃度分別為5、25、50 μg/mL和75 μg/mL的脫鹽玉米肽，作用Caco-2細(xì)胞6 h后，棄掉上清液，對照組加入DMEM培養(yǎng)基，H2O2組和樣品組每孔加入2 mL 200 μmol/L H2O2溶液培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)液體，加入適量胰蛋白酶消化細(xì)胞、適量培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞沉淀，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞后加入高效RIPA裂解液，4 ℃裂解20～30 min，10 000 r/min離心5 min后，上清液分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩y定時，取適量細(xì)胞裂解液放置于冰浴中，按照SOD、CAT、GR、γ-GCS試劑盒說明書進(jìn)行測定，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計，單位為U/mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin軟件繪圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，通過Duncan檢驗進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米肽納濾脫鹽工藝的操作溫度和操作壓力的確定

2.1.1 操作溫度對納濾膜通量的影響

在壓力20 bar、頻率50 Hz、時間0.5 h、玉米肽體積6.4 L的條件下，測定不同操作溫度下納濾膜的膜通量，實驗結(jié)果如圖1所示。隨著操作溫度的升高，納濾膜的膜通量不斷增大，這是因為溫度直接影響納濾膜的孔徑、阻力以及濃縮液的黏度，升高操作溫度可以降低納濾膜對玉米肽的阻力，增加溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)，降低濃差極化程度，進(jìn)而使膜通量升高[15]。但是，當(dāng)操作溫度由20 ℃升高到23 ℃時，膜通量無顯著性變化（P＞0.05），并且較高的溫度可能會影響玉米肽的生物活性，因此，選擇納濾的操作溫度為20 ℃。

上述研究表明，數(shù)字學(xué)術(shù)的出現(xiàn)對英國高校圖書館的服務(wù)產(chǎn)生了一定的影響，英國高校圖書館界逐步意識到數(shù)字學(xué)術(shù)能力的重要性，以及開展數(shù)字學(xué)術(shù)支持的重要性，并通過設(shè)置相應(yīng)職位、開展具體服務(wù)等方式支持?jǐn)?shù)字學(xué)術(shù)。英國高校圖書館的數(shù)字學(xué)術(shù)服務(wù)實踐，對我們多角度地了解數(shù)字學(xué)術(shù)環(huán)境及高校圖書館的數(shù)字學(xué)術(shù)服務(wù)發(fā)展方向具有積極的借鑒意義。本文對英國高校圖書館開展的數(shù)字學(xué)術(shù)服務(wù)實踐進(jìn)行調(diào)查分析，以期為我國高校圖書館的相關(guān)服務(wù)提供參考。

圖 1 操作溫度對玉米肽脫鹽納濾膜通量的影響Fig. 1 Effect of operating temperature on nanofiltration membrane flux

2.1.2 操作壓力對納濾膜通量的影響

圖 2 操作壓力對玉米肽脫鹽納濾膜通量的影響Fig. 2 Effect of operating pressure on nanofiltration membrane flux

壓力是影響納濾膜通量的重要因素[23]。在溫度20 ℃、頻率50 Hz、時間30 min、玉米肽體積6.4 L的條件下，測定不同操作壓力下納濾膜的膜通量，結(jié)果如圖2所示。隨著操作壓力的增大，納濾膜的滲透性增加，濾出液的體積逐漸上升，膜通量逐漸增大。這是由于操作壓力的增大會加快膜面液體的流速，此時膜面的蛋白質(zhì)層堆積得比較松弛，膜的污染速度減慢，提高了納濾膜的分離性能[24]。但是，當(dāng)壓力由20 bar升高到25 bar時，膜通量無顯著性變化（P＞0.05），可能是由于壓力過大使納濾膜逐漸被壓密，總阻力也隨壓力的增加而增大，導(dǎo)致納濾膜損傷加重。所以，選擇納濾時的操作壓力為20 bar。

2.2 玉米肽納濾脫鹽工藝的確定

2.2.1 納濾脫鹽對玉米肽溶液電導(dǎo)率和短肽回收率的影響

在溫度20 ℃、頻率50 Hz、壓力20 bar的條件下，玉米肽連續(xù)納濾5 次，每次體積濃縮倍數(shù)為2，測定5 次納濾脫鹽后電導(dǎo)率和短肽回收率的變化情況，實驗結(jié)果如圖3所示。由圖3A可知，脫鹽前玉米肽的電導(dǎo)率為6.38 mS/cm，隨著納濾次數(shù)的增加，玉米肽濃縮液和濾出液的電導(dǎo)率均不斷下降，間接說明玉米肽溶液中的鹽分含量不斷下降。與未納濾玉米肽相比，經(jīng)5 次納濾脫鹽后，濃縮液的電導(dǎo)率下降了33.86%。當(dāng)納濾次數(shù)從3增加到5時，雖然濾出液的電導(dǎo)率下降幅度較小，彼此之間無顯著性差異，但濃縮液的電導(dǎo)率繼續(xù)顯著下降，說明當(dāng)納濾次數(shù)為5時，可以有效去除玉米肽溶液中的鹽分。

由圖3B可以看出，隨著納濾次數(shù)的增加，玉米肽的短肽回收率逐漸下降，納濾5 次時，短肽回收率達(dá)96.73%，比納濾前降低了3.27%，說明納濾去除鹽分的同時也有一部分游離氨基酸或者二肽被損失掉。

圖 3 納濾脫鹽對玉米肽溶液電導(dǎo)率（A）和短肽回收率（B）的影響Fig. 3 Effect of nanofiltration desalting on conductivity (A) and short peptide recovery (B)

2.2.2 納濾脫鹽對玉米肽溶液中Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脫鹽率的影響

圖 4 納濾脫鹽對玉米肽溶液中Na＋質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脫鹽率的影響Fig. 4 Effect of nanofiltration desalting on Na+ concentration and desalting efficiency

在溫度20 ℃、頻率50 Hz、壓力20 bar的條件下，玉米肽連續(xù)納濾5 次，每次體積濃縮倍數(shù)為2，測定玉米肽溶液中的Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)及脫鹽率隨納濾次數(shù)的變化情況，實驗結(jié)果如圖4所示。脫鹽前玉米肽的Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.00%，這部分鹽分是玉米肽制備過程中為維持pH值穩(wěn)定滴加NaOH溶液而形成的，這對玉米肽作為一種功能性食品是不利的。隨著納濾次數(shù)的增加，玉米肽溶液中Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷下降，在納濾次數(shù)為5時，Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)比納濾前降低63.09%；另一方面，隨著納濾次數(shù)的增加，玉米肽溶液的脫鹽率逐漸增加，在納濾次數(shù)為5時，玉米肽的脫鹽率達(dá)70.73%。杜璟等采用截留分子質(zhì)量160 Da的納濾膜對玉米降血壓肽進(jìn)行脫鹽處理時，在初始條件下（約pH 8.0），經(jīng)90 min處理后，脫鹽率為76.82%[15]。說明在納濾脫鹽過程中，有一部分Na+與玉米肽結(jié)合較緊密，即使持續(xù)加水也無法除去；隨著納濾的進(jìn)行，納濾膜表面肽濃度會逐漸增加，導(dǎo)致納濾膜表面上形成了凝膠層，即使不斷加水循環(huán)沖洗也不能完全消除，造成部分Na+與之結(jié)合而不能完全除盡。因此，經(jīng)5 次納濾操作才基本可以達(dá)到對玉米肽脫鹽的目的。

2.2.3 納濾對玉米肽抗氧化活性的影響

圖 5 納濾次數(shù)對玉米肽羥自由基和DPPH自由基清除率（A）以及亞鐵離子螯合率（B）的影響Fig. 5 Effect of nanofiltration number on hydroxyl and DPPH radical scavenging capacities (A) and ferrous ion chelating capacity (B) of corn peptide

由圖5A可知，隨著納濾次數(shù)的增加，玉米肽對DPPH自由基和羥自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。與未納濾處理樣品相比，在納濾次數(shù)為4時，納濾處理后玉米肽對DPPH自由基和羥自由基的清除能力顯著增加（P＜0.05），分別增加21.98%和45.87%，可能是由于納濾4 次時，短肽回收率高達(dá)97.3%，沒有導(dǎo)致具有抗氧化活性的玉米肽損失，在此基礎(chǔ)上，鹽分的除去使玉米肽的純度增大，導(dǎo)致玉米肽的自由基清除能力增強(qiáng)。于國才等用截留分子質(zhì)量160 Da的納濾膜對玉米肽進(jìn)行脫鹽處理時，發(fā)現(xiàn)隨著納濾次數(shù)的增加，玉米肽清除羥自由基的能力不斷增加[14]。Bourseau等也發(fā)現(xiàn)在酶解后采用壓力驅(qū)動的納濾膜進(jìn)行脫鹽，可以提高魚蛋白水解產(chǎn)物的比活力[25]。與納濾前相比，納濾次數(shù)為5時玉米肽的DPPH自由基和羥自由基清除率分別提高21.55%和35.93%。

由圖5B可知，與未納濾玉米肽相比，納濾次數(shù)增加到3時，樣品的亞鐵離子螯合能力無顯著性差異，當(dāng)納濾次數(shù)為4時，樣品的亞鐵離子螯合能力顯著增加，比對照組增加4.53%；繼續(xù)增加納濾次數(shù)時，玉米肽對亞鐵離子螯合的能力顯著降低，比對照組降低了7.38%，可能此時有部分具有螯合亞鐵離子的玉米肽樣品損失或活性位點被納濾時的剪切力所破壞。

綜合圖3～5分析，確定玉米肽納濾脫鹽的工藝參數(shù)為溫度20 ℃、頻率50 Hz、壓力20 bar、納濾5 次，每次體積濃縮倍數(shù)為2。

2.3 脫鹽玉米肽的細(xì)胞水平抗氧化活性

2.3.1 脫鹽玉米肽對Caco-2細(xì)胞的毒性效應(yīng)

圖 6 不同質(zhì)量濃度脫鹽玉米肽對Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig. 6 Effect of desalted corn peptide at different concentrations on Caco-2 cell viability

基于結(jié)構(gòu)和氨基酸組成的不同，肽類物質(zhì)具有不同的細(xì)胞毒性作用[26]。將脫鹽玉米肽作用Caco-2細(xì)胞24 h后測定細(xì)胞存活率，以表征脫鹽玉米肽對Caco-2細(xì)胞的毒性效應(yīng)，實驗結(jié)果如圖6所示。與對照組相比，在5～200 μg/mL范圍內(nèi)，隨著脫鹽玉米肽質(zhì)量濃度的增加，Caco-2細(xì)胞存活率逐漸增加，但均沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；當(dāng)玉米肽質(zhì)量濃度為500 μg/mL時，細(xì)胞存活率顯著增加（P＜0.05），比對照組高5.94%；脫鹽玉米肽的質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，Caco-2細(xì)胞的存活率略有下降，但與對照組之間也沒有顯著性差異，說明在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，脫鹽玉米肽對Caco-2細(xì)胞沒有毒性，甚至有一定的增殖效果，這與Jiang Yuan等的實驗結(jié)果[27]相一致。

2.3.2 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中脫鹽玉米肽對Caco-2細(xì)胞存活率的影響

圖 7 脫鹽玉米肽對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig. 7 Effect of desalted corn peptide on H2O2-induced Caco-2 cell viability

將Caco-2細(xì)胞用脫鹽玉米肽預(yù)處理6 h，然后暴露于200 μmol/L氧化劑H2O2中以進(jìn)一步評估其對氧化性損傷的保護(hù)作用，實驗結(jié)果如圖7所示。與對照組相比，用200 μmol/L H2O2刺激Caco-2細(xì)胞4 h，細(xì)胞存活率極顯著降低，降低了15.21%，表明H2O2破壞了Caco-2內(nèi)抗氧防御系統(tǒng)和氧自由基的動態(tài)平衡，Caco-2氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。在H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激之前，用脫鹽玉米肽預(yù)處理Caco-2細(xì)胞6 h，均可以提高受損細(xì)胞的存活率，且提高效應(yīng)隨著玉米肽質(zhì)量濃度的增加而增加。在質(zhì)量濃度為5 μg/mL時，脫鹽玉米肽處理使細(xì)胞存活率由H2O2氧化應(yīng)激組的84.79%提高到92.94%，說明低質(zhì)量濃度脫鹽玉米肽具有很強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用，保護(hù)Caco-2細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷，分析可能的原因是脫鹽玉米肽具有較低的分子質(zhì)量和較高的疏水性，可有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與參與氧化應(yīng)激途徑的物質(zhì)相互作用[28-29]，加速清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基而提高了細(xì)胞存活率。

2.3.3 脫鹽玉米肽對H2O2誘導(dǎo)的氧化性損傷Caco-2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響

表 1 脫鹽玉米肽對H2O2誘導(dǎo)的氧化性損傷Caco-2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響Table 1 Effect of desalted corn peptide on antioxidant enzyme activities in H2O2-induced Caco-2 cells

為了進(jìn)一步證明脫鹽玉米肽的抗氧化能力，研究了其對氧化性損傷Caco-2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（包括CAT、SOD、γ-GCS和GR）活力的影響，實驗結(jié)果如表1所示。與對照組相比，Caco-2細(xì)胞在200 μmol/L的H2O2中暴露4 h后，Caco-2細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD、γ-GCS和GR的活力分別降低了77.07%、31.70 %、67.38%和70.40%，說明在200 μmol/L的H2O2中暴露4 h，Caco-2細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激。但是，用質(zhì)量濃度為5～75 μg/mL的脫鹽玉米肽預(yù)處理6 h后再暴露于H2O2中，脫鹽玉米肽以濃度依賴的方式抑制了氧化應(yīng)激細(xì)胞中抗氧化酶活力的降低。

SOD是超氧陰離子自由基清除因子，是生物體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)[30]。與H2O2組相比，隨著脫鹽玉米肽質(zhì)量濃度的增加，雖然SOD的活力逐漸增加，但僅75 μg/mL玉米肽可以使SOD活力顯著增加，比H2O2組增加了60.50%，且與對照組間差異不顯著（P＞0.05）。由此說明，脫鹽玉米肽可以緩解由超氧陰離子自由基誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞的氧化性損傷。

γ-GCS是合成谷胱甘肽（glutathione，GSH）的限速酶，GR可以催化谷胱甘肽二硫化物還原為GSH，γ-GCS和GR活力的升高可以促進(jìn)GSH的合成，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞清除過氧化物的能力[31]。隨著脫鹽玉米肽質(zhì)量濃度的增加，γ-GCS和GR的活力逐漸增加，與H2O2組相比，50 μg/mL玉米肽可以使γ-GCS和GR的活力顯著增加，分別是H2O2組的2.57 倍和1.96 倍，說明脫鹽玉米肽通過增強(qiáng)γ-GCS和GR活性而對細(xì)胞內(nèi)GSH合成產(chǎn)生積極影響，可以緩解由過氧化物誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞的氧化性損傷。

CAT是催化H2O2分解成氧和水的酶，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[28]。隨著脫鹽玉米肽質(zhì)量濃度的增加，CAT的活力逐漸增加，與H2O2組相比，50 μg/mL玉米肽可以使CAT的活性極顯著增加（P＜0.01），是H2O2組的2.70 倍。因此，脫鹽玉米肽可以加速H2O2分解，降低由H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞的氧化性損傷。

綜上所述，脫鹽玉米肽通過增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活力，加速細(xì)胞內(nèi)H2O2、超氧陰離子等活性氧自由基的清除，進(jìn)而拮抗了H2O2誘導(dǎo)的Caco-2的氧化性損傷。Wang Liying等報道了相似的結(jié)果，玉米肽可以上調(diào)HepG2細(xì)胞中的內(nèi)源性抗氧化酶活力而抵抗氧化應(yīng)激[28]。研究表明，抗氧化肽的這種功能與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1-核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件（Keap1-Nrf2-ARE）信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子信號通路和絲裂原活化蛋白激酶信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān)[32-33]。因此，在本研究基礎(chǔ)上，需要進(jìn)一步從分子水平上研究脫鹽玉米肽拮抗H2O2誘導(dǎo)的氧化性損傷的確切作用機(jī)理。

3 結(jié) 論

玉米肽制備過程中引入的鹽分限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。本實驗采用截留分子質(zhì)量150 Da的納濾膜對玉米肽進(jìn)行脫鹽處理，以膜通量、電導(dǎo)率、Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)、脫鹽率和產(chǎn)物抗氧化活性等為檢測指標(biāo)，確定了不影響玉米肽抗氧化活性的納濾工藝參數(shù)。另外，質(zhì)量濃度為5～1 000 μg/mL的脫鹽玉米肽對Caco-2細(xì)胞沒有毒性，質(zhì)量濃度為75 μg/mL的脫鹽玉米肽可通過提高細(xì)胞內(nèi)的SOD、GR、CAT和γ-GCS抗氧化酶活力而顯著提高由H2O2誘導(dǎo)的氧化性損傷的Caco-2細(xì)胞存活率。在此基礎(chǔ)上，需要對脫鹽玉米肽的抗氧化機(jī)制進(jìn)一步進(jìn)行研究。