何蕾

(新疆大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830046)

0 引言

多孔硅是一種具有大的比表面積、良好的生物兼容性、易于功能化的新型納米材料，可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需要制備成具有不同光子晶體結(jié)構(gòu)的光學(xué)器件，并作為良好的基底材料應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域．和以往其他光素類衍生物相比，羅丹明類染料是生物技術(shù)中常用的蛋白質(zhì)分析染料之一，它價格低廉、易于標(biāo)記、結(jié)構(gòu)高度剛化、光穩(wěn)定性強(qiáng)、波長范圍較寬、光產(chǎn)率高、p H敏感性低，做為光標(biāo)記物可廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，可用于制備高靈敏度的光生物傳感器[1-5]．納米金因其具有表面等離子體共振效應(yīng)，可增強(qiáng)其表面及附近的光物質(zhì)的光發(fā)射強(qiáng)度[6-10]，這一特性被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、光電器件等領(lǐng)域．此外，納米金還具有易于鏈接生物的特性，從而增強(qiáng)生物傳感器的穩(wěn)定性，已被廣泛應(yīng)用于生物分子檢測[11-14]．Zhang Miaorong等人利用納米金的修飾增強(qiáng)了多孔硅的拉曼信號[15]，SHI Fugui等人利用納米金增強(qiáng)了多孔硅中羅丹明的光信號[16]，LIYanyu等人利用量子點(diǎn)標(biāo)記生物探針的方法進(jìn)行生物分子檢測[17]，但目前尚未見在納米金修飾的多孔硅中采用羅丹明6G光標(biāo)記法檢測生物分子的報道．

本實(shí)驗(yàn)成功制備了納米金修飾的多孔硅基底材料，利用納米金的等離子體效應(yīng)增強(qiáng)了多孔硅中光標(biāo)記物的光信號，以提高光生物傳感器的靈敏度，通過鏈接生物光探針后光信號強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)生物濃度檢測，可實(shí)現(xiàn)低成本、易標(biāo)記、穩(wěn)定性好、靈敏度高的生物大分子的檢測，其檢測極限為121 nM．

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羅丹明6G染料分子的尺寸直徑分布在7.5～8.5 nm之間，顏色呈橘紅色，其光峰位置位于582 nm左右，激發(fā)波長為500 nm，如圖1．

1.2 多孔硅器件的制備

電化學(xué)腐蝕法所用的硅片電阻率為1～7?· m，晶向?yàn)椋?00＞，N型硅．腐蝕前先將硅片依次放入丙酮、酒精、去離子水中進(jìn)行10 min超聲清洗，以去除表面污染物，用40%HF和98%無水乙醇（體積比為3∶1）的混合溶液作為腐蝕液，用計算機(jī)控制腐蝕的電流和時間．本實(shí)驗(yàn)采用的電流及時間參數(shù)分別為J=30 mA· m-2，t=10 min，如圖2所示多孔硅樣品的孔徑分布在500 nm左右，孔徑尺寸較大的優(yōu)越條件為之后納米金的沉積、光標(biāo)記分子進(jìn)入、生物分子的檢測提供了有利條件，圖3為多孔硅樣品的截面形貌圖．

圖1 激發(fā)光為500 nm的羅丹明6G的光致發(fā)光光譜Fig 1 Photoluminescence spectra of Rhodamine 6G at an excitation wavelength of 500 nm

圖2 多孔硅樣品的表面形貌圖Fig 2 Surface morphology of porous silicon sample

圖3 多孔硅樣品的截面形貌圖Fig 3 Cross-section morphology of porous silicon sample

腐蝕后樣品在去離子水中清洗并在室溫下干燥，放置在雙氧水(30%)中80℃條件下氧化3 h．最后將樣品浸沒在甲醇和去離子水稀釋后的氨丙基三乙氧基硅烷（去離子水∶甲醇∶APTES=10∶10∶1體積比）溶液中室溫下1 h，以完成氨基化，為納米金顆粒的沉積及后期樣品醛基化提供基礎(chǔ)條件．氨基化后，將樣品在甲苯中清洗以除去未鏈接上的多余的APTES，并在100℃條件下烘烤10 min．

1.3 納米金/多孔硅基底材料的制備

在多孔硅樣品上沉積金納米粒子的方法如下：在100 mL水中加入2 mL、0.1 mM的氯金酸溶液直至沸騰，之后快速加入4 mL（1.1 mM）檸檬酸三鈉溶液，20 min后，停止加熱并將溶液靜置2 h，之后再將氨基化后的多孔硅樣品在納米金膠溶液中浸泡8 h，浸泡后樣品在去離子水中清洗并在空氣中干燥．納米金顆粒的尺寸約為10 nm左右，本實(shí)驗(yàn)中制備的多孔硅樣品的孔徑約為500 nm，其尺寸大小為Au顆粒、RB分子及生物分子的進(jìn)入提供了足夠的空間．沉積金納米顆粒后，將樣品放入2.5%的戊二醛溶液中浸泡1 h使多孔硅表面完全被醛基修飾，取出后用PBS（p H=7.4）和去離子水反復(fù)沖洗，并干燥．

1.4 納米金/多孔硅鏈接目標(biāo)DNA

用PBS將目標(biāo)DNA稀釋為1.25μM、2.5μM、3.125μM、5μM、10μM五個濃度，將以上不同濃度的目標(biāo)DNA分別用移液器滴加在多孔硅樣品上，放入37℃恒溫箱中2 h，取出后用PBS沖洗，N2中干燥．再放入3 M的EA中浸泡，放置37℃恒溫箱中1 h，取出后用HEPES（p H=9）緩沖液徹底沖洗．

1.5 Rh6G對探針DNA的標(biāo)記

20個堿基的DNA分子尺寸約6 nm，采用PBS緩沖液將生物探針DNA濃度調(diào)整為10 mg/mL，取5 mL生物探針分子溶液置于10 mL小燒杯內(nèi)，將2 mL Rh6G溶液(5×10-4M)立即緩慢滴加于生物探針分子溶液內(nèi)，邊加邊輕攪，其后避光震蕩室溫下反應(yīng)3 h．為檢測DNA特異性反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中分別標(biāo)記互補(bǔ)DNA探針1和非互補(bǔ)DNA探針2．如圖4所示，Rh6G光位于582 nm，在探針DNA和Rh6G偶聯(lián)后，Rh6G-DNA溶液的光峰移動到587 nm，發(fā)光峰移動了5 nm，表示Rh6G成功標(biāo)記了探針DNA分子，光強(qiáng)度的減弱可能是因?yàn)镽h6G標(biāo)記后濃度減小，也可能是生物分子的猝滅作用，偶聯(lián)后Rh6G-DNA發(fā)光光譜仍然較窄，說明偶聯(lián)后的Rh6G-DNA分散性仍然較好．

圖4 Rh6G與Rh6G+DNA熒光譜對比圖Fig 4 The fluorescence spectra of Rh6G and Rh6G+DNA

1.6 目標(biāo)DNA和探針Rh6G-DNA雜交反應(yīng)

取50μL Rh6G-DNA溶液滴加到已經(jīng)鏈接目標(biāo)DNA分子的多孔硅表面，37℃恒溫反應(yīng)2 h，使DNA充分雜交反應(yīng)，然后取出用PBS和DI反復(fù)沖洗以去除未反應(yīng)完全的DNA，N2中干燥．

2 樣品的檢測

3 分析與討論

3.1 Au納米顆粒有效增加熒光染料分子熒光信號的分析

圖 5 (1)多孔硅本身的熒光(黑色)；(2)鏈接10 μM的生物分子的多孔硅樣品鏈接生物探針后的熒光(紅色)；(3)鏈接10μM的生物分子的Au/多孔硅鏈接生物探針后的熒光(藍(lán)色)Fig 5 (1)Fluorescence of porous silicon(black);(2)Fluorescence of porous silicon with biological probes(10μM)(red);(3)Fluorescence of Au/porous silicon with biological probes(10μM)(blue)

3.2 DNA的特異性反應(yīng)及互補(bǔ)DNA濃度的檢測

圖6為Au/多孔硅上目標(biāo)DNA和Rh6G-DNA雜交反應(yīng)后的光光譜圖．其中紅色線為10μM目標(biāo)DNA與非互補(bǔ)的光標(biāo)記生物探針反應(yīng)后的光譜圖，可見非互補(bǔ)的光標(biāo)記生物探針由于不能發(fā)生雜交反應(yīng)，而未鏈接至多孔硅中，因此其無光峰．采用此方法可有效檢測生物分子是否可發(fā)生特異性反應(yīng)，圖中其余譜線分別為不同濃度的目標(biāo)分子與互補(bǔ)光標(biāo)記生物探針分子發(fā)生雜交反應(yīng)的光譜圖．由圖可見反應(yīng)后光峰在565 nm附近，這可能是因?yàn)榧尤氲募{米Au的負(fù)介電常數(shù)性質(zhì)使Rh6G原有的582 nm的峰位移至565 nm附近，也可能是因?yàn)殒溄由锖驲h6G粒子間極偶相互作用受到影響，從而使光峰藍(lán)移．圖中565 nm位置對應(yīng)的光譜峰的強(qiáng)度與加入的目標(biāo)生物分子的濃度成正比，因此，光信號的強(qiáng)弱可直接反映出目標(biāo)生物分子濃度大小，即可成功實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)生物分子濃度的檢測．

圖6 Au/多孔硅上不同濃度的目標(biāo)DNA和Rh6GDNA探針雜交反應(yīng)后的熒光光譜圖Fig 6 Fluorescence spectra of Au/porous silicon at different concentrations Rh6G-DNA after hybridization

圖7 檢測目標(biāo)DNA濃度從1.25μM到10μM的線性擬合關(guān)系圖Fig 7 The linear fitting diagram of the detection target DNA concentration from 1.25μM to 10 μM

圖7為檢測目標(biāo)DNA濃度從1.25μM到10μM的線性擬合關(guān)系圖，線性回歸方程是Y=24.1+8.25X，其中Y是光強(qiáng)度值，X代表目標(biāo)DNA生物分子濃度．利用計算機(jī)軟件Origin進(jìn)行擬合，擬合系數(shù)為0.996 84，擬合度非常高．光儀的分辨率為0.1，因此該生物傳感器的檢測限為0.1/(8.25/μM)=121 nM．

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功制備了納米金修飾的多孔硅生物傳感器基底材料，將不同濃度的目標(biāo)DNA鏈接至Au/多孔硅基底，再鏈接羅丹明6G標(biāo)記的生物探針分子，利用納米金的等離子體效應(yīng)有效增強(qiáng)了鏈接到多孔硅中的光標(biāo)記生物探針的光信號．根據(jù)鏈接光探針后多孔硅光信號強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)對DNA分子特異性反應(yīng)的檢測．通過分析目標(biāo)DNA分子的濃度對光信號強(qiáng)度的影響，可表征互補(bǔ)DNA生物分子的濃度，其檢測限為121 nM，對生物大分子實(shí)現(xiàn)了低成本、易標(biāo)記、穩(wěn)定性好、靈敏度高的檢測．