石書(shū)婧 侯君 梁華 王學(xué)霞 蘇蘭 耿紅亞 張曉嵐 田永濤 王建國(guó)

鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤 (sinonasal inverted papilloma,SNIP)是一種良性腫瘤，起源于鼻側(cè)壁或鼻竇的呼吸型(呼吸器型)上皮[1-3]。10%～25%的SNIP 患者具有局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)化為鼻竇鱗狀細(xì)胞癌的可能[1，4，5]。目前發(fā)病機(jī)制仍不明確。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial mesenchymal transition, EMT）是生物體發(fā)生發(fā)展及上皮性腫瘤癌變的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程[6，7]。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子ZEB2 與EMT 相關(guān)，是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)ZEB2 蛋白在SNIP 及增生鼻甲組織中的表達(dá)差異，并探討其表達(dá)水平與SNIP 發(fā)生、發(fā)展及惡變的關(guān)系。

資料與方法

1 材料

1.1標(biāo)本

收集2016～2018年在我院經(jīng)病理證實(shí)的新鮮標(biāo)本共71 例，其中SNIP 51 例、增生鼻甲組織（鼻中隔矯正術(shù)中切取的增生鼻甲組織）20 例。SNIP 組，男 31 例，女 20 例，年齡 22～74 歲，中位年齡 52.5歲；對(duì)照組（增生鼻甲組織），男11 例，女9 例，年齡20～59 歲，中位年齡48 歲，兩組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有病例入院前未進(jìn)行過(guò)放療及化療等治療措施，見(jiàn)表1。

1.2試劑

ZEB2 兔源多克隆抗體（Bioworld）、通用 SP 試劑盒（小鼠/兔鏈霉卵白素-生物素法檢測(cè)系統(tǒng)）和DAB（中杉金橋）。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組

首先分為對(duì)照組和SNIP 組。SNIP 組根據(jù)復(fù)發(fā)與否、Krouse（2000年）SNIP 臨床分期標(biāo)準(zhǔn)及病理分型分別分為初發(fā)組和復(fù)發(fā)組；Ⅰ期、Ⅱ期組和Ⅲ期、Ⅳ期組；無(wú)不典型增生組、伴不典型增生組和惡變組[8]。

2.2采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)石蠟切片中ZEB2蛋白的表達(dá)。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色。常規(guī)烤片、脫蠟及水化，將切片放入沸騰的檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行高壓抗原修復(fù)5min，蒸餾水沖洗，室溫冷卻后PBS 液漂洗，3%過(guò)氧化氫甲醇避光處理10min 以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS 漂洗后使用10%山羊血清封閉非特異性抗原，棄血清加一抗（ZEB2 兔源多克隆抗體），PBS 緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，4℃冰箱過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育15min 后進(jìn)行漂洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15min，再次漂洗后滴加DAB 顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染、1%鹽酸乙醇分化、蒸餾水返藍(lán)、脫水、透明、封片。

2.3結(jié)果判定

結(jié)果由兩名對(duì)患者信息不知情的病理科醫(yī)生進(jìn)行判定。每張切片高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇5 個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè)。以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)。陽(yáng)性細(xì)胞比例：≦10%為1 分，＞10%且＜50%為2分，＞50%為3 分；染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例乘積得分為0～4 分者為陰性，6、9 分為陽(yáng)性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用 χ2檢驗(yàn)或 Fishier 確切概率法，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 ZEB2 蛋白在對(duì)照組及SNIP 組中的表達(dá)差異

ZEB2 陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在SNIP 組中表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕褐色顆粒，陽(yáng)性表達(dá)率為45.1%，而在對(duì)照組中表達(dá)明顯減弱甚至出現(xiàn)表達(dá)缺失，陽(yáng)性表達(dá)率為15%，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖1。

表1 ZEB2 蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表2 ZEB2 蛋白在不同病理分型SNIP 與對(duì)照組的比較

圖1 ZEB2 蛋白在對(duì)照組及不同病理分型的SNIP 組織中的表達(dá)

2 ZEB2 與SNIP 組臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

結(jié)果顯示：ZEB2 蛋白表達(dá)水平與SNIP 患者性別、年齡、臨床分期和有無(wú)復(fù)發(fā)無(wú)明顯相關(guān)（P＞0.05），而與病理分化程度有關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表 1，隨病理分化程度降低ZEB2 表達(dá)量增加（見(jiàn)圖1）。

3 ZEB2 蛋白在不同病理分化程度SNIP 與對(duì)照組的比較

結(jié)果顯示：ZEB2 蛋白在對(duì)照組、SNIP 無(wú)不典型增生組、伴不典型增生組、伴惡變組中的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高分別為15%、31%、56.2%、83.3%，其中伴不典型增生組、伴惡變組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而無(wú)不典型增生組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

討論

鼻乳頭狀瘤或鼻竇乳頭狀瘤是一種良性上皮性腫瘤，由鼻腔和鼻竇周圍的施耐德氏膜形成，組織形態(tài)學(xué)上可分為外生性、內(nèi)翻性和癌細(xì)胞型三種類型，其中內(nèi)翻性約占所有鼻乳頭狀瘤的47%[9]。SNIP 可發(fā)生于任何年齡段，但更常見(jiàn)于五六十歲的男性，此腫瘤與其他鼻腔腫瘤相比有以下三個(gè)特點(diǎn)：較強(qiáng)的局部破壞潛力、較高的復(fù)發(fā)率和癌變的風(fēng)險(xiǎn)。迄今為止，SNIP 的確切病因尚不明確，研究表明其發(fā)病原因可能與病毒感染、炎癥刺激及上皮化生等相關(guān)[10]。

EMT 使上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)特性，顯著增加腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲性[11]，通常認(rèn)為EMT 與腫瘤的發(fā)生、惡性進(jìn)展、細(xì)胞遷移及腫瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)。EMT 常被定義為上皮標(biāo)志物（如E-cadherin）表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物（如N-cadherin、Vimentin）表達(dá)增加。此外，EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（TFs），如 SNAI（SNAI1/Snail 和SNAI2/Slug）、ZEB（ZEB1 和 ZEB2）、TWIST（TWIST1和TWIST2）等核蛋白可以通過(guò)不同的信號(hào)通路[12]來(lái)抑制E-cadherin 的表達(dá)，從而調(diào)控EMT 過(guò)程。E 盒結(jié)合鋅指蛋白2（zinc finger E－box binding homeobox 2, ZEB2）是E 盒結(jié)合鋅指蛋白家族成員之一，屬于鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育和腫瘤進(jìn)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。ZEB2 被廣泛認(rèn)為是EMT 的誘導(dǎo)劑，易翔等[13]研究表明ZEB2 在鼻咽癌組織中表達(dá)明顯升高，其高表達(dá)可能促進(jìn)EMT 發(fā)生，進(jìn)而增加鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移幾率。Chen 等[14]研究發(fā)現(xiàn)ZEB2 在鼻咽癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，miRNA-30a 在鼻咽癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)降低，ZEB2 是miRNA-30a 在人鼻咽癌中的靶點(diǎn)，miRNA-30a 通過(guò)直接與ZEB2的3-UTR 結(jié)合而負(fù)調(diào)控其表達(dá)水平，miR-30a 過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制ZEB2 的表達(dá)，增加人鼻咽癌細(xì)胞的凋亡水平，抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Pan等[15]研究發(fā)現(xiàn)MTBP 可能通過(guò)上調(diào)ZEB2 表達(dá)誘導(dǎo)EMT 過(guò)程，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲性。Suzuki 等[16]進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，ZEB2 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)，下調(diào)ZEB2 的表達(dá)可抑制腫瘤侵襲性。Gao 等[17]研究表明miRNA-1179 在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，miRNA-1179 低表達(dá)的肝癌患者有著更高的轉(zhuǎn)移率(淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)，預(yù)后更差，miRNA-1179 的過(guò)表達(dá)減弱了肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，ZEB2 被證實(shí)是miRNA-1179 的直接靶點(diǎn)，其水平被miRNA-1179 負(fù)調(diào)控。ZEB2 在肝癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)，ZEB2 的高表達(dá)預(yù)示肝癌患者的預(yù)后較差。ZEB2 的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miRNA-1179 對(duì)HCC 細(xì)胞增殖和遷移能力的抑制作用。以上研究表明：ZEB2 在鼻咽癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌及膠質(zhì)瘤中高表達(dá)并且與腫瘤侵襲性有關(guān)。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定ZEB2 蛋白在SNIP 組及對(duì)照組中的表達(dá)情況并行相關(guān)分析，結(jié)果表明：ZEB2 蛋白表達(dá)水平在SNIP 組中明顯升高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其表達(dá)水平與性別、年齡等因素?zé)o明顯相關(guān)，與病理分型有關(guān)（P＜0.05），其表達(dá)量隨SNIP 病理分化程度降低而增加，這與上述研究報(bào)道的結(jié)果相符，其中伴不典型增生組、伴惡變組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而無(wú)不典型增生組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。該結(jié)果提示：ZEB2 的高表達(dá)與SNIP 的發(fā)生、發(fā)展及惡變有關(guān)，檢測(cè)ZEB2 的表達(dá)在預(yù)測(cè)SNIP 惡變、評(píng)估預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療等方面可能具有重要意義。此外，在該研究中，我們還進(jìn)行了E-cadherin 表達(dá)的測(cè)定，結(jié)果顯示：E-cadherin 在SNIP 中的表達(dá)量低于對(duì)照組，且隨SNIP 病理分化程度的降低表達(dá)量逐漸下降，ZEB2 與E-cadherin 相關(guān)性分析顯示兩者之間存在負(fù)相關(guān)，該結(jié)果亦提示ZEB2 可能通過(guò)影響EMT 進(jìn)程進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡變，這方面的內(nèi)容將在后續(xù)的文章中進(jìn)行敘述。