周惠萍，周東海，彭宇軒**

(1．湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院)

苦瓜(momordica charantia L)是葫蘆科植物，其苦寒、無(wú)毒、除邪熱、解疲乏、清心明目、益氣壯陽(yáng)[1]，具有多種藥理特性，如抗高血糖、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用[2]，主要成分為多糖、蛋白質(zhì)、類黃酮、三萜等[3]。多糖廣泛存在于植物中，在臨床上常用作治療劑，主要作用是增強(qiáng)和激活巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)、抗腫瘤活性、促傷口愈合和其他治療作用[4]。本研究探討了苦瓜多糖(momordica charantia polysaccharide，MCP)對(duì)環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CY)誘導(dǎo)免疫抑制小鼠免疫功能的影響，及可能的作用機(jī)制，為更好地開(kāi)發(fā)苦瓜的藥理作用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)KM雄性小鼠，體重(30±2)g，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物自由攝食和飲水，在室溫(24±1)℃、濕度(65±5)%、晝夜12h交替標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件下，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑

苦瓜多糖(含量為90%，西安萬(wàn)方生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2018092801)；環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)15073125)；印度油墨(北京來(lái)寶科技有限公司)；豚鼠血清(江萊生物)；ConA(康朗生物)；無(wú)菌Hanks和RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibico公司)；CCK-8(Bioss公司)。

1.1.3 儀器

酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛公司，型號(hào)MK3)；全自動(dòng)血液分析儀(日本希森美康公司，型號(hào)F2340)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛公司，型號(hào)3423)；電子天平(北京賽多利斯公司，型號(hào)BSA124S-CW)；超潔凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司，型號(hào)SW-SJ-2FD)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組及處理

參考文獻(xiàn)方法[5-6]造小鼠免疫功能低下模型，將50只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組10只，即正常對(duì)照組(C)、CY模型對(duì)照組(M)、低劑量治療組(T1)、中劑量治療組(T2)和高劑量治療組(T3)。第1d至3d，除正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水外，其他各組于小鼠腹腔注射CY 80mg/kg。在第4d至10d，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃雙蒸水，對(duì)低、中和高劑量組小鼠分別灌胃MCP 1次，劑量分別是50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg。在最后一次喂藥24h后進(jìn)行采樣檢測(cè)。

1.2.2 小鼠WBC計(jì)數(shù)的測(cè)定

全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組抗凝血白細(xì)胞水平。

1.2.3 小鼠免疫器官指數(shù)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第10d，稱量小鼠的體重后，使用頸椎脫臼法處死小鼠，分別對(duì)小鼠的胸腺和脾臟精準(zhǔn)稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，公式如下：

胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g)

脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)

1.2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定[7]

無(wú)菌取小鼠脾臟，放入無(wú)菌Hanks液中，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液。通過(guò)1 000rpm離心5min進(jìn)一步純化細(xì)胞懸液，棄上清液。將沉淀的細(xì)胞與無(wú)菌蒸餾水1mL混合約30s，之后加入1mL 1.8%NaCl。接著用無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞懸液3遍，調(diào)整脾細(xì)胞懸液最終濃度至1×10-6個(gè)/mL。將脾細(xì)胞懸液分兩孔加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，再加入7.5μL ConA，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h。每孔加入10μL CCK-8后，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育4h，在酶標(biāo)儀450nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖比例，公式如下：

淋巴細(xì)胞增值比例(%)=A(實(shí)驗(yàn)組)/A(對(duì)照組)×100%

1.2.5 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬作用的測(cè)定[8]

在最后一次給藥后，將印度墨水稀釋5倍，然后以10mL/kg的劑量通過(guò)尾靜脈注射，通過(guò)眼眶兩次采集血液共20μL，時(shí)間分別是注射印度墨水后2min(t1)，和注射印度墨水后10min(t2)，隨后立即將血液與4mL 0.1%(w/v)Na2CO3溶液混合。最后在酶標(biāo)儀680nm的波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度OD1和OD2值，計(jì)算小鼠的碳粒廓清指數(shù)(κ)和吞噬指數(shù)(α)，公式如下：

(BM：體重；LM：肝臟重量；SM：脾臟重量)

1.2.6 小鼠血清溶血素的測(cè)定[9]

在給藥第6d腹腔注射20%兔紅細(xì)胞懸液0.2mL/只進(jìn)行免疫。在第10d處死小鼠后制備血清。兔紅細(xì)胞用生理鹽水1 000r/min，5min洗滌3次備用。將0.1mL小鼠血清、0.9mL生理鹽水、0.25mL的豚鼠血清和0.25mL 1.5%的兔紅細(xì)胞懸液加到離心管中，混勻后置于37℃的水浴箱中1h，隨后以2 500rpm/min離心5min，吸取上清液，最后在酶標(biāo)儀450nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCP對(duì)小鼠WBC計(jì)數(shù)的影響

由表1可見(jiàn)，CY模型組小鼠的WBC計(jì)數(shù)較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明造模成功；MCP中、高劑量組小鼠WBC計(jì)數(shù)較CY模型對(duì)照組均明顯增加(P<0.05或P<0.01)，說(shuō)明MCP對(duì)免疫抑制小鼠的WBC計(jì)數(shù)有明顯提升作用。

表1 MCP對(duì)免疫抑制小鼠WBC計(jì)數(shù)，臟器指數(shù)以及溶血素的影響

2.2 MCP對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

由表1可見(jiàn)，CY模型對(duì)照組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明小鼠免疫功能受到明顯抑制；MCP中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)較CY模型對(duì)照組明顯升高(P<0.05或P<0.01),說(shuō)明隨著MCP治療劑量的增加，免疫抑制小鼠的臟器指數(shù)逐漸增加，但MCP高劑量組的臟器指數(shù)仍低于空白對(duì)照組。

2.3 MCP對(duì)小鼠溶血素水平的影響

由表1可見(jiàn)，CY模型組小鼠的溶血素水平較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；MCP高劑量組小鼠的溶血素水平較CY模型對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。說(shuō)明MCP對(duì)免疫抑制小鼠的溶血素水平有一定改善作用。

2.4 MCP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

由圖1可見(jiàn)，CY模型組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；MCP中、高劑量組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖較CY模型對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明MCP可有效促進(jìn)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。

與CY模型對(duì)照組比較，**P<0.01

2.5 MCP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響

由圖2可見(jiàn)，CY模型對(duì)照組小鼠的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)較正常對(duì)照組皆明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明CY明顯降低了小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬作用；MCP高劑量組小鼠的廓清指數(shù)較CY模型對(duì)照組升高(P<0.05)，MCP中、高劑量組小鼠的吞噬指數(shù)較CY模型對(duì)照組升高(P<0.05)。說(shuō)明MCP對(duì)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬作用有一定提升。

(a)小鼠廓清指數(shù) (b)小鼠吞噬指數(shù)

3 討 論

在科學(xué)研究領(lǐng)域，CY常用于構(gòu)建免疫功能低下或免疫功能抑制的動(dòng)物模型。本研究以CY 80mg/kg連續(xù)3d腹腔注射構(gòu)建免疫抑制小鼠模型，觀察到模型組小鼠體重減輕，脫毛現(xiàn)象明顯，與眾多文獻(xiàn)一致[10-11]。本研究結(jié)果表明CY模型對(duì)照組小鼠的WBC計(jì)數(shù)較正常對(duì)照組小鼠顯著下降(P<0.05)。WBC計(jì)數(shù)下降常見(jiàn)于病毒感染、自身免疫性疾病、急性白血病、藥物性骨髓抑制等，本研究表明致使WBC計(jì)數(shù)下降的原因是藥物性骨髓抑制劑CY的使用，說(shuō)明本研究免疫功能抑制小鼠模型構(gòu)建成功。

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，兩者的發(fā)育狀況與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，所以通過(guò)胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的大小能夠反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[12]。本研究模型對(duì)照組小鼠的臟器指數(shù)較正常對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CY使小鼠胸腺和脾臟重量明顯減輕，與蔡帆等[13]研究相一致。MCP低劑量組小鼠臟器指數(shù)較模型對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而MCP中、高劑量組小鼠臟器指數(shù)較模型對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明在運(yùn)用MCP治療過(guò)程中，能在一定程度上糾正胸腺和脾臟萎縮，減輕CY對(duì)小鼠免疫器官的損害，但與正常小鼠相比仍有一定的差異，沒(méi)有完全恢復(fù)到正常狀態(tài)。

血清溶血素的變化可從分子水平反映機(jī)體體液免疫功能狀態(tài)。本研究表明MCP低、中劑量組小鼠溶血素水平較模型對(duì)照組略微升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，MCP高劑量組小鼠溶血素水平較模型對(duì)照組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明隨著MCP治療劑量的增加，小鼠的血清溶血素水平在逐漸提升，有一定量效相關(guān)性，故MCP可減輕CY對(duì)小鼠體液免疫功能的抑制作用，促使小鼠免疫功能逐漸恢復(fù)。

機(jī)體免疫功能分為特異性免疫和非特異性免疫，淋巴細(xì)胞可反映機(jī)體特異性免疫功能的狀態(tài)，而巨噬細(xì)胞的吞噬作用可反映機(jī)體非特異免疫功能的強(qiáng)弱。淋巴細(xì)胞增殖是特異性免疫激活的關(guān)鍵過(guò)程，脾臟中含有大量的淋巴細(xì)胞，因此，脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)是檢驗(yàn)淋巴細(xì)胞活力的重要方法[14]。本研究結(jié)果表明模型組免疫抑制小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值率低，在MCP以200mg/kg濃度治療下，可使小鼠脾淋巴細(xì)胞增值率恢復(fù)，說(shuō)明MCP能夠有效刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。巨噬細(xì)胞作為非特異性免疫重要一員，具有極強(qiáng)吞噬異物的特性。本研究結(jié)果顯示，高劑量的MCP能明顯提高免疫抑制小鼠的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，故MCP可有效提高機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能。

綜上，可認(rèn)為MCP是一種免疫促進(jìn)劑，它既能促進(jìn)機(jī)體的體液免疫功能，又能增強(qiáng)特異性和非特異性免疫，從而有效地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，具有一定的研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。