柳 國，李婷婷，李月生，陳洪國，吳鳴虎

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院核技術與化學生物學院)

智能水凝膠是一種能根據環(huán)境變化或外部刺激、體積或者其他物理化學性質產生快速變化的特殊水凝膠[1]。三維網絡多孔結構是水凝膠可通過原位裝載或后裝載的方式，利用三維網絡微結構的改變來獲得藥物控制釋放[2]。當病變部位的溫度、pH值、磁場等外部環(huán)境信息發(fā)生變化后，智能水凝膠可在病灶部位產生特別的刺激應答，發(fā)生相應的物理-化學性質變化。因此，智能水凝膠在藥物載體領域的研究和應用日益受到關注[3]。

對單一刺激敏感水凝膠的研究已經取得了顯著的進展，但大多數水凝膠不能在接收到某種環(huán)境刺激時產生瞬間和顯著的響應。因此，制備多重敏感水凝膠藥物載體是解決上述問題的理想方法。溫度和pH值是體內重要的環(huán)境因素，并且一些疾病往往伴隨著溫度或pH值的變化[4]。Zhan等[5]制備了同時具有多重響應性的聚(N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)納米水凝膠藥物載體，在病變部位具有良好的緩釋效果。在水凝膠結構中引入均勻分散的納米粒子可以作為物理填料吸收裂紋擴展釋放的能量，達到提高水凝膠機械強度的目的；同時一些具有磁性的納米粒子的引入還可能賦予水凝膠新的性能。

傳統(tǒng)的水凝膠合成工藝需要添加引發(fā)劑和催化劑等，導致聚合產物的純度低，聚合反應過程較慢、效率低，聚合反應可控性低，合成過程易產生污染物等缺點[6]。相比之下，輻射技術制備的優(yōu)勢主要體現在：輻射合成方法簡單，無相關物質殘留；常溫下即可反應；聚合反應程度易于控制；反應得到的聚合物分子質量及其分布更易控制等[7]。

我們以NIPAAm/HHPC/Fe3O4(NHF)三元復合水凝膠為藥物載體材料，BSA為模型藥物，構建一種智能水凝膠給藥系統(tǒng)，水凝膠的多孔結構及其官能團等可以通過靜電作用力、疏水作用力、氫鍵等吸附BSA，利用熒光分光光度計等手段驗證了復合水凝膠對BSA的吸附機理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)購自薩恩化學技術(上海)有限公司，高取代羥丙基纖維素(H-HPC)購自濟南金輝化工有限公司，牛血清白蛋白(BSA)購自上海瑞永生物科技有限公司，氯化鉀(KCl)AR購自上海麥克林生化科技有限公司，氯化鈉(NaCl)AR、磷酸二氫鉀(KH2PO4)AR、十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) AR、磷酸氫二鉀(K2HPO4)AR均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

電子束加速器(1MeV電壓1000kv)購自美國wasik公司，真空包裝機 (DZ-400B)購自上海嘉賽，真空干燥箱(DZF-6030)、恒溫鼓風干燥箱(DHG-9030A)購自上海一恒科學儀器有限公司，精密增力電動攪拌器(JJ-1)購自江蘇金壇市城東新瑞儀器廠，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (DF-101S)購自鞏義予華儀器有限責任公司，熒光分光光度計(F96PRO)購自上海棱光科技有限公司，電子天平(HX502T)購自慈溪市天東衡器廠。

1.2 NHF三元復合水凝膠的輻射制備

稱取質量為10g的N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)單體于三口燒瓶中，向燒瓶中加入100g去離子水，超聲處理約10min待單體完全混合均勻后，常溫下磁石攪拌(轉速350r/min)，并連續(xù)通氮氣30min，保證無氧條件下，用注射器將其注入聚乙烯袋(200mm×150mm)中并用真空包裝機密封。利用1MeV電子束加速器，在室溫下用電子束輻照單體溶液，輻照總劑量為25kGy，劑量率5kGy/pass，即可得到質量濃度為10%的PNIPAAm預聚體。稱取質量為10g高取代羥丙基纖維素(HHPC)溶解在100g的去離子水中，于200mL燒杯中用電動攪拌器機械攪拌至完全溶解后，用聚乙烯膜密封燒杯口，靜置去除氣泡，即可得到質量濃度為10%的HHPC溶液。將一定量Fe3O4加入到5.0mL去離子水中形成乳化液。將10%的NIPAAm預聚物溶液與10%的HHPC溶液以及Fe3O4乳化液按照一定比例混合，充分混合后加入到90mm培養(yǎng)皿中，鋪盤得到3mm厚的膜，空白樣品加入相同量的水，在室溫下用電子束輻照(50kGy，5kGy/pass)，即可得到NHF水凝膠三元復合水凝膠。

1.3 吸附實驗

1.3.1 NHF水凝膠在不同pH條件下對BSA的吸附實驗

用熒光分光光度計測量NHF水凝膠的體外載藥性能，將緩沖液用鹽酸和氫氧化鈉調至pH分別為3.0、4.0、5.0、7.4、8.0、9.0。用不同pH值的緩沖液配制3×10-5mol/L的BSA溶液，分別取20mL BSA溶液于小燒杯中，然后將烘干后的水凝膠浸泡其中，整體密封并置于冰箱中冷藏1d，待吸附飽和后，用熒光分光光度計分別測量水凝膠樣品在不同pH溶液飽和吸附后，BSA母液的熒光值，每次平行測量3次，結果取平均值，并繪制藥物負載曲線。

1.3.2 NHF水凝膠在不同溫度下對BSA的吸附實驗

用熒光分光光度計測量NHF水凝膠的體外載藥性能，將BSA溶解于具有最佳吸附量的緩沖液中，并配制成3×10-5mol/L的BSA溶液。分別取20mL BSA溶液于標號為1～5的四個小燒杯中，將烘干后的水凝膠分別浸泡在室溫20℃、25℃，水凝膠相變溫度(LCST)32℃，人體正常體溫37℃、42℃的溶液中，靜置12h，待吸附飽和后，用熒光分光光度計測量BSA母液的熒光值，每次平行測量三次，結果取平均值，并繪制藥物負載曲線。

1.3.3 NHF水凝膠在不同外加磁場強度下對BSA的吸附實驗

用熒光分光光度計測量NHF水凝膠的體外載藥性能。用PBS緩沖液配制3×10-5mol/L的BSA溶液，分別取20mL BSA溶液于小燒杯中，通過控制外加磁鐵的數量(1～5)，使得外加磁場強度分別為：1MF、2MF、3MF、4MF、5MF，然后將烘干后的水凝膠浸泡其中并將其置于不同外加磁場強度下，整體密封并置于冰箱中冷藏1d，待吸附飽和后，用熒光分光光度計測量BSA母液的熒光值，每次平行測量3次，結果取平均值，并繪制藥物負載曲線。

2 結 果

2.1 NHF水凝膠在不同pH條件下對BSA的吸附行為

從圖1可以看出，飽和吸附后的BSA母液的熒光值大小順序為：pH=9.0>pH=8.0>pH=4.0>pH=5.0>pH=3.0>pH=7.4>control。pH=3.0時，BSA在溶液中的疏水性最小，水凝膠與BSA分子之間主要存在疏水作用力，兩者之間的疏水作用力最小[8]，有利于水凝膠對BSA的吸附。因此，BSA在pH=3.0時的熒光值較低。pH=4.0～5.0時，此時pH值接近蛋白質等電點，BSA聚集程度較高[8]，容易團聚，體積較大，不利于在水凝膠中自由進出。當pH=5.0時，BSA團聚程度大，BSA被水凝膠吸附后不容易從它的網絡結構中游離出來。pH=7.4時pH值大于等電點，破壞了BSA分子內部的親水-疏水平衡,導致疏水性核的包埋和分子的變性，而且此時BSA在溶液中的疏水作用力最強[8]。水凝膠中的N-異丙基為疏水基團，兩者之間的疏水作用力最大，此時水凝膠更傾向于發(fā)生吸水溶脹，使得母液中BSA濃度較高。pH=8.0～9.0時，BSA在溶液中的疏水作用力相同，但此時水凝膠-COOH被電離成-COO-。隨著溶液pH值的增加，水凝膠內部孔徑在靜電排斥力作用下逐漸變大，BSA表面的負電荷也逐漸增加[8]。水凝膠對BSA的靜電排斥也更強，水凝膠吸附的BSA逐漸減少。

圖1 NHF水凝膠在不同pH值下吸附BSA后溶液的熒光值

2.2 NHF水凝膠在不同溫度下對BSA的吸附行為

由圖2可知，隨著溫度升高，水凝膠對BSA的吸附呈下降趨勢，主要原因是：PNIPAM的分子結構里同時含有疏水性的異丙基和親水性的酰胺基團。溫敏型的PNIPAM的LCST為32℃，生理溫度為37℃，故而將溫度設置在20℃～42℃進行討論。在TLCST時，整個PNIPAM由疏水性的異丙基基團主導，酰胺基團與H2O分子之間的氫鍵發(fā)生斷裂，水凝膠溶脹很小。在溫度為40℃時，NHF水凝膠的內部骨架無法舒展開來，水凝膠幾乎無法溶脹[9]，因此，吸附BSA的能力也相應較低。

圖2 NHF水凝膠在不同溫度下負載BSA前后溶液的熒光值差

2.3 NHF水凝膠在不同外加磁場下對BSA吸附性能

由圖3可知，對照組(a)與實驗組(b、c、d、e、f、g)相比，加入NHF水凝膠后，實驗組在對BSA飽和吸附后的母液的熒光值均比對照組濃度大，這是水凝膠親水性比較強，優(yōu)先吸附水分子，進而導致溶液溶度變高的原因。由于實驗組(c、d、e、f、g)中引入了外加磁場，水凝膠樣品對BSA飽和吸附后母液的熒光值變低，可能原因是：磁性水凝膠中的Fe3O4納米粒子被磁化并相互吸引，從而減小了水凝膠的體積，壓縮了三維網絡結構，降低了孔隙率。從而引起水凝膠對BSA的吸附量減少[10]。另一方面，隨著外加磁場強度(MF)越來越大，溶液的熒光值也變越來越大。主要原因是水凝膠中的磁性功能粒子被磁化，在磁場作用下，納米Fe3O4載體會振蕩而起到泵的作用效應越來越強，不利于BSA的吸附。因此，外加磁場強度越大，越不利于水凝膠對BSA的吸附。

圖3 NHF水凝膠在不同外加磁場下對BSA的吸附性能

3 討 論

以NIPAAm、HHPC、Fe3O4為主要基材，利用電子束預輻射法成功制備了NIPAAm/HHPC/Fe3O4(NHF)三元協調響應的智能水凝膠。重點評價了NHF水凝膠在不同的pH、溫度、磁場條件下，對模擬藥物BSA的吸附行為及其機制。結果表明：NHF水凝膠對BSA可能的吸附機制被提出。由于pH的不同，靜電排斥力、疏水作用力等會引起水凝膠與BSA分子之間的相互作用機制不同。此外，溫度的差異也會導致水凝膠骨架的伸展與收縮，引起水凝膠對BSA飽和吸附量的變化。當然，外加磁場強度越大，越不利于水凝膠對BSA的吸附。因此，NHF水凝膠可以通過溫度、pH、磁三元協同調控藥物的吸附與釋放，這一特性有望在醫(yī)用藥物控釋與給藥遞送系統(tǒng)等方面得到應用。